scDiagnostics: systematic assessment of cell type annotation in single-cell transcriptomics data

あなたは、混雑した部屋の中で容疑者を特定しようとしている探偵だと想像してください。あなたには、既知の人々（パン屋、消防士、教師、医師）が写った巨大で完璧なフォトアルバム（リファレンス・データセット）があります。そして、ラベルを貼るべき新しい群衆のライブビデオ映像（クエリ・データセット）も手元にあります。

通常、科学者は、ビデオの中の人々をアルバムの写真と照合するために「ラベル転送（Label Transfer）」ツールを使用します。それは、「あの男は写真のパン屋に99%似ているので、彼はパン屋だ！」と判断する超高速ロボットのようなものです。

しかし、ここで問題が発生します。もしビデオの中にいる人が、実はパン屋ではなかったらどうでしょう？ もし彼が、ウイルスに感染して青く光り、バイナリコードで話すようになった「サイボーグのパン屋」だったら？ ロボットは「パン屋」の特徴だけを見ているため、自信満々に「パン屋！」と言うかもしれません。なぜなら、ロボットは「サイボーグ」がどのような姿をしているのかを知らないからです。ロボットは、たとえそれが間違った箱であっても、新しい奇妙な人物を最も近い既存の箱に無理やり押し込んでしまうのです。これは、シングルセル生物学において、研究者が健康なフォトアルバムを使って病気の患者の細胞をラベル付けしようとする時に起こる現象です。

そこで登場するのが scDiagnostics です。scDiagnosticsは、ラベルを付けるためのツールではなく、「疑念計（suspicion meter）」だと考えてください。それは細胞に名前を推測しようとするのではなく、その細胞が与えられた名前に本当に適合しているかどうかをチェックするのです。

scDiagnostics の 3 つの超能力

著者たちは、細胞が本来属すべきではないカテゴリーに「強制的に」分類されるのを防ぐために、このツールを構築しました。彼らは3つの巧妙なトリックを使用しています。

1. 魔法の鏡（投影 - Projection）: ビデオの群衆を、フォトアルバムのフロアプラン上に投影することを想像してください。もしビデオ内の「パン屋」たちが、アルバムの「パン屋」たちの真上にぴったりと着地していれば、すべては順調です。しかし、もし細胞のグループが、割り当てられたグループから遠く離れた、変で空っぽのコーナーに着地したとしたら、scDiagnosticsはレッドフラッグ（警告）を掲げます。
2. 双子のテスト（アライメント - Alignment）: これは、ビデオの「パン屋」たちが、実際にアルバムの「パン屋」たちと同じ見た目をしているかを確認するものです。彼らは同じ身長、体重、スタイルを持っていますか？ もしビデオの「パン屋」たちが突然宇宙服を着ていたら（これは病気の兆候です）、このテストは不一致を検知します。
3. アウトライヤー・レーダー（異常検知 - Outlier Detection）: これが最もエキサイティングな部分です。これは「変人」を見つけ出すための特別なアルゴリズム（隔離フォレスト/isolation forest と呼ばれるもの）を使用しています。「誰が隅っこで一人ぼっちで立っているのか？」と問いかけます。論文のテストにおいて、このレーダーは標準的なツールが見逃した細胞を、見事にフラグ立てすることに成功しました。

大規模なテスト：シミュレーションと実生活

著者たちは、これが単なる推測ではないことを証明するために、このツールを徹底的に検証しました。

まず、偽のデータを使ったゲームを行いました。
彼らは、A、B、Cという3種類の細胞を持つシミュレーションの世界を作成しました。次に、フォトアルバム（リファレンス）からは細胞タイプCを隠し、ビデオ（クエリ）の中には保持しておきました。標準的なロボットがビデオをラベル付けしようとすると、欠落しているCの細胞を、あたかもAやBであるかのように振る舞わせようとしました。

• 結果: scDiagnosticsは即座にトラブルを察知しました。偽の「C」の細胞は、どこにも適合しなかったため、高い「疑念スコア」を獲得しました。論文では、これらのシミュレーションにおいて、このツールが本物のマッチングと、無理やり分類されたものを明確に区別できることが示されています。

次に、現実世界の謎、COVID-19に挑みました。
彼らは、健康な人々（アルバム）の血球細胞を、COVID-19患者（ビデオ）の血球細胞と比較しました。

• 謎: 標準的なツールはある特定の免疫細胞（CD14+ モノサイト）を「健康なモノサイト」としてラベル付けしました。
• ひねり: scDiagnosticsは、これらの細胞の一部を「異常（anomalous）」としてフラグ立てしました。著者らが詳しく調べたところ、これらの「異常な」細胞は、実際にはインターフェロン（警告信号）を大量に放出している、極めて活動的な「ウイルスと戦うマシン」であることが判明しました。
• 証拠: もしscDiagnosticsを使っていなければ、この発見は逃していたでしょう。健康なモノサイトと、超活性化したウイルス細胞を平均化してしまい、信号を希釈させていたはずです。論文によると、「異常な」細胞は IFI6 という遺伝子に対して 2.30 の遺伝子発現変化（log2-fold change）を示しましたが、「正常に見える」細胞の変化はわずか 0.49 でした。このツールがなければ、この巨大な差は見過ごされていたはずです。

最後に、お腹の調子が悪いマウス（結腸炎）を観察しました。
組織内の細胞の位置を特定できるハイテク顕微鏡（MERFISH）を使用して、炎症を起こした腸を持つマウスを観察しました。

• 発見: 標準的なツールは、多くの「線維芽細胞（fibroblasts）」（支持細胞）を検出しました。scDiagnosticsは、奇妙な動きをしている特定の線維芽細胞のグループを特定しました。
• 文脈: これらの「奇妙な」線維芽細胞は、侵入してきた免疫細胞（好中球）や損傷した組織のすぐそばに位置していました。一方で、健康な線維芽細胞は、本来あるべき場所である幹細胞の近くに留まっていました。
• 影響: 「病的な」線維芽細胞を「健康な」ものから分離することで、著者らは、病的な細胞が免疫細胞に対して異なる化学的メッセージ（Il1b や Cxcl5 など）を送っている一方で、健康な細胞は異なる信号（Wnt5a など）を送っていることを明らかにできました。この近隣環境の再編（リワイヤリング）は、scDiagnosticsがグループを分割するまで、不可視の状態でした。

scDiagnostics が「しない」こと

このツールが「何ではないか」を知っておくことも重要です。

• これは、ラベルを与えるツール（SingleR、Azimuth、CellTypistなど）に取って代わるものではありません。それらと「並行して」機能します。
• このツールは、新しい細胞が「何であるか」を魔法のように知ることはできません。ただ、「おい、このラベルは適合していないぞ！」と言うだけです。
• 論文では、標準的なツールの「信頼度スコア（confidence score）」が高いことが、必ずしもそのラベルが正しいことを意味するという考え方に明確に反対しています。COVID-19の例では、標準的なツールはそれらの細胞が健康なモノサイトであると非常に高い確信（高いスコア）を持っていましたが、それは間違いでした。scDiagnosticsは、信頼性だけでは不十分であることを証明したのです。

まとめ

この論文は、私たちがより多くの細胞を分析していく中で、ラベル付けを行うロボットを盲目的に信頼してはいけないことを示唆しています。時には、細胞が新しい何か、病的な何か、あるいは私たちがまだ見たことのない何かを行っていることがあります。

scDiagnosticsは、いわばセーフティネットです。間違った箱に無理やり押し込まれている細胞を捕まえます。シミュレーションにおいて、それは高い感度と特異性を示しました。COVID-19と結腸炎の実データにおいて、それは以前は隠されていた疾患シグナルを明らかにしました。著者たちは、このツールが探偵の道具箱の標準的な一部となり、私たちが細胞を「タイプA」と呼ぶとき、それが単に他の選択肢が尽きたからではなく、本当にそこに属していると確信できることを保証することを願っています。

そして最も素晴らしい点は、これが無料のオープンソースであり、誰もが自分の研究成果をチェックするために利用できるということです。