SAP loss limits anti-insulin atypical B cell activation and pro-inflammatory CD8 T cells despite preserved Tfh responses to protect against type 1 diabetes

技術要約：SAPによる損失限界：1型糖尿病を防ぐための、非定型B細胞活性化および抗インスリン特異的B細胞と炎症性CD8+ T細胞の抑制

問題提起
1型糖尿病（T1D）の病態には、自己反応性CD4+ T細胞が病原性CD8+ T細胞をライセンス（活性化）し、膵β細胞を破壊することが関与している。B細胞は抗原提示を行いこのプロセスを駆動することが知られているが、T1DにおけるT-B相互作用を制御する具体的なメカニズムは依然として不明である。具体的には、胚中心（GC）形成およびT細胞濾胞ヘルパー（Tfh）細胞とB細胞の相互作用に不可延な分子であるSLAM関連タンパク質（SAP）が、糖尿病を引き起こす抗インスリンB細胞とT細胞の病原性相互作用に必要であるかどうかが不明である。BCL6欠損（GC応答と細胞外濾胞（EF）応答の両方をブロックする）を用いた先行研究では糖尿病の保護が示されたが、GC経路とEF経路の寄与の違いは分離されていない。

方法論
本研究では、IgH標的B細胞受容体トランスジーンを保有し、野生型NODマウスと比較してT1Dの発症を加速させる1〜3%の抗インスリンB細胞集団を生成するVH125SD.NODマウスモデルを利用した。著者らは、GC応答を消失させる一方でEF応答を維持するVH125SD.SAP-/- .NOD (VH125SD∆SAP) マウスを作製した。

主な実験アプローチは以下の通りである：

• 糖尿病モニタリング： 10〜40週齢の雌マウスにおける週次の血糖値測定。
• 組織学： 膵臓のH&E染色および免疫組織化学染色（CD3, B220）による、膵島炎の重症度および三次リンパ構造（TLS）の組織化の評価。
• フローサイトメトリー： 高次元スペクトルフローサイトメトリーと最小限の教師あり解析（Phenograph, opt-SNE）を用い、脾臓、膵リンパ節（pLN）、および膵臓におけるB細胞サブセット（GC、非定型、メモリー様）およびT細胞サブセット（Tfh、Tph、CD8+ エフェクター、Tpex）を特性評価。
• 免疫化： 抗インスリンB細胞応答をT細胞依存的およびT細胞非依存的（TLR4）経路の両方を通じて誘導するため、インスリンとBrucella abortusリングテスト抗原（insulin-BRT）を結合させた抗原を用いて免疫化した。これにより、GC不在下でのEF応答の評価を可能にした。
• 共役解析： 直接的なT-B相互作用マーカーを評価するために、in vivoにおけるB細胞-CD4+ T細胞の共役体を特定。
• サイトカイン刺激： PMA/イオノマイシン刺激後の細胞内サイトカイン染色（IFN-γ, IL-21）。

主な結果

1. 糖尿病の保護とGCの喪失： VH125SD∆SAPマウスは、VH125SDコントロールと比較してT1Dの発症率が有意に低下した。この保護は、末梢のレパートリーに抗インスリンB細胞が存続しているにもかかわらず起こった。予想通り、SAPの欠損により、pLNおよび膵臓におけるGC B細胞の形成が消失した。
2. 膵島炎の持続と組織化されたTLSの減少： 糖尿病は予防されたものの、SAP欠損マウスにおいても膵島炎は持続していた。しかし、「離散的」なB/T細胞領域（組織化されたTLS）を持つ膵島の割合は有意に減少しており、組織化されたリンパ構造は一般的な浸潤よりもSAPに依存していることが示唆された。
3. 抗インスリンB細胞活性化の障害： SAP不在下では、抗インスリンB細胞の増殖（Ki67）、共刺激分子（CD86）の上昇、および活性化マーカー（CD44）の発現が減少した。これらの欠陥は、非GC（細胞外濾胞）B細胞において観察された。
4. SAP依存的な非定型B細胞の拡大： insulin-BRT免疫後、SAP欠損マウスでは特定の非定型B細胞集団（CD11c+ T-bet+ および CD11b+ CD11c+）の拡大が認められなかった。SAP充足マウスにおけるこれらの非定型サブセットは、高い共刺激分子（CD80, CD86）の発現を示し、IgG2aクラススイッチを起こしていた。対照的に、メモリー様（CD80+ PDL2+）および抗体産生細胞（CD138+）集団はSAP欠損マウスでも維持されており、これら特定のEFアウトカムに対してSAPは必須ではないが、非定型B細胞の拡大には不可欠であることを示している。
5. 保持されたTfh表現型と相互作用の障害： 定義されたTfh（CXCR5hi PD-1hi）およびTph（ICOShi PD-1hi CXCR5-）細胞は、SAP欠損マウスにおいても正常な活性化マーカー（ICOS, CD69, CD44）の発現およびサイトカイン産生を伴って存続していた。しかし、SAP欠損マウスにおけるB細胞-CD4+ T細胞の共役体は、CD44および炎症性マーカーであるCCR6の発現が有意に減少しており、Tfh細胞が存在するにもかかわらず、T-B間のコミュニケーションが損なわれていることを示した。
6. 炎症性CD8+ T細胞の減少： SAPの欠損は、膵臓における、特に前駆疲弊（Tpex）集団としてのインスリン反応性CD8+ T細胞の減少を導いた。さらに、SAP欠頻欠損マウスにおける総CD8+ T細胞は、組織へのホーミングおよびβ細胞破壊に関連するマーカーであるCXCR3+およびIFN-γ+細胞の頻度が減少していた。

意義および主張
著者らは、SAPが、T1Dの進行を支持するプロ炎症的な抗インスリンB-T相互作用を媒介する上で不可欠な役割を果たしていると主張している。本研究は、SAP欠損による糖尿病の保護が、Tfh細胞の欠如や抗インスリン抗体の生成不全によるものではなく、以下の特定の障害によるものであることを示している：

• 抗インスリンB細胞の活性化および増殖、特に非定型サブセットの活性化。
• 効果的なT細胞ライセンスに必要なB細胞上の共刺激分子の上昇。
• プロ炎症性CD8+ T細胞（特にTpexおよびIFN-γ+ エフェクター）のダウンストリームのプログラミング。

本論文は、SAP依存的な非定型B細胞の活性化を含む主要なT-B共存相互作用を阻害することで、末梢の抗インスリンBリンパ球が集積する場合であっても、糖尿病の発症を変化させることができると結論付けている。これは、SAPを介したT-Bコミュニケーションまたは特定の非定型B細胞の活性化を標的とする治療戦略が、すべての抗インスリンB細胞応答を排除することなく、T1Dの進行を防ぐ可能性があることを示唆している。