Mechanism-based prediction of insertion-driven high pathogenicity avian influenza virus emergence

問題
高病原性鳥インフルエンザウイルス（HPAIV）であるH5およびH7亜型は、主にヘマグルチニン（HA）タンパク質におけるマルチベーシック切断部位（MBCS）の獲得を通じて、低病原性（LPAIV）の先祖から出現する。ヌクレオチドの挿入は、このモチーフを生成するための再発性のメカニズムであるが、これらの挿入を駆動する分子決定因子は不明なままである。具体的には、特定のHA配列がHPAIVへと進化しやすい遺伝的素因を持っているのか、あるいは、特定の二次RNA構造（静的なステムループや、ポリメラーゼ外で形成される一過性のテンプレートループ構造など）がポリメラーゼのスリッページ（滑り）の主要な駆動因子であるのかは明らかになっていない。これらのメカニズムを理解することは、どの循環中のLPAIV配列がHPAIVへと進化するリスクがあるかを予測する上で極めて重要である。

方法論
著者らは、挿入によるHPAIVの出現メカニズムを調査するために、実験ウイルス学、ディープシーケンシング、および熱力学モデリングを組み合わせた。

• 実験系: 彼らは、関心のあるHA遺伝子をH7N1バックボーンのPAオープンリーディングフレームの下流に非翻訳性トランスジーンとして挿入する、逆遺伝学システムを開発した。これにより、ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）は、HAタンパク質の機能に対する選択圧を受けることなく、HA配列を複製することができる。
• シーケンシング: 彼らは、Illuminaベースのシングルストランド・コンセンサス・シーケンシング（SSCS）を利用して、高い感度（$2 \times 10^{-6}$まで）でヌクレオチド挿入を検出し、ウイルス回収中に逆転写酵素やヒトRNAポリメラーゼIによって導入されるエラーを補正した。
• 変異導入: 彼らは、予測される静的なステムループ構造や一過性のテンプレートループ構造を変化させるように設計された変異体、および様々な長さのアデニン・トラクトを含む、様々なH5およびH7変異体を設計した。
• モデリング: 彼らは、ウイルスRdRpの触媒部位内で形成されるプロダクト–テンプレート二重鎖の熱力学的安定性に基づく数学的モデル、HPAIVpredictを開発した。このモデルは、(i) オリジナルの二重鎖とバックトラックした二重鎖の間の安定性の差（$\Delta\Delta G$）、および (ii) 再結合した二重鎖における3'末端のマッチまたはミスマッチの性質、という2つの予測因子を組み込んでいる。また、不安定な中間状態を必要とするスリッページイベントを排除するための、熱力学的経路アクセシビリティ基準も含まれている。
• 検証: モデルは、H5およびH1変異体の実験データを用いて学習され、自然界におけるH5およびH7のHPAIV出現イベント、およびGISAIDのLPAIVデータベースに対して検証された。

主な貢献

• メカニズムの洞察: 本研究は、局所的なヌクレオチド配列と、RdRp触媒部位内でのプロダクト–テンプレート二重鎖の熱力学的安定性が、二次RNA構造ではなく、ヌクレオチド挿入の主要な決定因子であることを特定した。
• 従来の仮説の反駁: 著者らは、予測される一過性のRNA構造（テンプレートループ）や静的なステムループ構造は、高頻度の挿入に必須ではなく、せいぜい挿入率に緩やかな影響を与えるだけであることを示した。
• 予測ツール: 彼らは、挿入プロファイルを予測し、挿入を介して機能的なMBCSを獲得しやすい配列背景を特定するツール、HPAIVpredictを導入した。
• 配列決定因子: 本研究は、少なくとも6個連続するアデニン（H5において）または5個連続するアデニン（H7において）のストレッチが、スリッページおよび再結合に許容的な周囲のヌクレオチドコンテキストと組み合わさることが、挿入駆動型のHPAIV出現の重要な前提条件であることを確立した。

結果

• 配列が挿入を駆動する: 実験データによれば、8個のアデニン・トラクトを含むPA-H5-Shim24a2b変異体は、親株であるPA-H5-Shimと比較して約600倍高い挿入頻度を示した。二次構造を変化させたものの、アデニン・トラクトの長さは同一である変異体は高い挿入頻度を維持したが、大きなステムループを持つものの短いアデニン・トラクトを持つ変異体は低い頻度を示した。
• 熱力学モデリング: 実験データで学習されたHPAIVpredictモデルは、挿入頻度の分散の69%を説明し（$R^2 = 0.69$）、トレーニング配列のウィンドウ平均頻度の予測において$R^2 = 0.83$を達成した。
• 自然発生イベント: 歴史的なH5およびH7の出現イベントの解析により、挿入駆動型のすべてのH5 HPAIVは、その前駆体に5〜8個連続するアデニン・ストレッチを保持しており、すべてのH7挿入駆動型イベントは、アデニン・トラクト形成を促進する特定のグアニンからアデニンへの置換パターンを含むアフリカ・ユーラシア・オセアニア（AEO）系統に由来することが明らかになった。
• データベース・スクリーニング: HPAIVpredictをGISAIDのLPAIV配列に適用したところ、インフレームの挿入によってフリン切断型MBCSを生成すると予測される稀な配列背景（例：特定のオーストラリアのH7およびジャリコ（Jalisco）のH5配列）が特定された。逆に、多くのアメリカ系統のH7およびオーストラリアのH5配列は、挿入駆動型のMBCS獲得に対して抵抗性があると予測され、これは彼らの既知の進化史（例：アメリカにおけるH7の組換えへの依存）と一致している。

意義
本論文は、二次RNA構造からポリメラーゼ活性部位内のプロダクト–テンプレート二重鎖の熱力学へと焦点を移すことで、ヌクレオチド挿入を介したHPAIVの出現を理解するためのメカニズム的枠組みを提供すると主張している。このメカニズムをHPAIVpredictとして定式化することにより、著者らは、循環中のH5およびH7のLPAIV配列のうち、HPAIVへと進化しやすい遺伝的素因を持つものを特定するための、公衆衛生および動物衛生コミュニティのための運用可能なツールを提供している。これにより、HPAIVの出現をその源泉から軽減することを目的とした配列ベースの監視戦略が可能になる。これらの知見はまた、挿入駆動型のHPAIVの出現がH5およびH7亜型に限定されている理由を説明するものであり、これは、他の亜型では満たされない特定の配列要件（アデニン・トラクトの形成、スリッページに許容的なコンテキスト、および塩基性アミノ酸をコードする能力）の収束に起因している。