Native in situ architecture of the human inactive X chromosome revealed by correlative light and electron microscopy

技術要約：ヒト不活性X染色質のネイティブな in situ アーキテクチャ

問題提起
ゲノムおよびコンフォメーション捕捉技術を通じて、クロマチンドメインの分子組織や不活性X染色体（Xi）による遺伝子サイレンシングの役割はよく解明されているが、これらのドメインの物理的な3次元超構造については依然として理解が進んでいない。従来の超解像蛍光顕微鏡法（例：3D-SIM）は、個々のヌクレオソームやインタークロマチンコンパートメント（IC）の詳細な構造を解像するには解像度が不足している。一方、従来の電子顕微鏡（EM）は、化学的固定、架橋、脱水によって導入されるアーティファクトにより、細胞の超構造が変化してしまう可能性がある。さらに、従来のEMには、間接的な形態学的手がかりに頼ることなく、Xiを他のヘテロクロマチン領域と区別するために必要な分子特異性が欠けている。したがって、高次クロマチン折り畳みやヘテロクロマチンの空間配置に関する議論を解決するために、分子特異性を持ちつつ、近原生（near-native）な条件下でXiを可視化する手法が切実に求められている。

方法論
著者らは、ヒト網膜色素上皮（RPE1）細胞におけるXiを観察するために、2つの補完的な相関光・電子顕微鏡（CLEM）ワークフローを採用した。

1. 分子標識戦略： Xiを特異的に同定するため、著者らは、Xiに豊富に存在するヒストンバリアントであるmacroH2A（mH2A）に、eGFPとAPEX2のタンデム融合を付加した細胞株を作製した。eGFPタグは光顕微鏡による局在化を容易にし、APEX2（修飾されたペルオキシダーゼ）は、DABおよびオスミウムとの反応を通じて、電子密度による特異的な電子顕微鏡標識を可能にする。
2. 従来型CLEMワークフロー： 細胞を化学的に固定し、APEX2反応を行い、プラスチック樹脂に埋没させた。これにより、以下が可能となった：
   • 光顕微鏡（eGFPシグナル）によるXiの同定。
   • APEX2標識されたクロマチンの透過電子顕微鏡（TEM）および電子線トモグラフィー（ET）による高コントラストイメージング。
   • Xiの構造を3次元ボリュームとして再構成するための、デュアルアキシス・チルトシリーズの取得。
3. クライオCLEMワークフロー： ネイティブな構造を保存するため、化学的固定や染色を行わずに細胞をガラス化（プランジ凍結）した。
   • 標的化： クライオ蛍光顕微鏡により、凍結されたグリッド上のeGFPシグナルを通じてXiを特定した。
   • ラメラ作製： 集束イオンビーム（FIB）ミリングを用いて、標的となるXiを含む薄いラメラ（厚さ約140–150 nm）を作成した。
   • クライオET： 低デフォーカスでのコントラストを高めるためにボルタ位相プレート（VPP）を利用した、Titan Krios顕微鏡によるデータ収集を行った。これにより、水和された近原生な状態で個々のヌクレオソームを解像することが可能となった。
4. データ解析： トモグラムを再構成し、デノイズ処理（クライオデータにはCryCareを使用）を行い、AI支援ツール（Amira）を用いてセグメンテーションを行い、クロマチン繊維の幅、インタークロマチンコンパートメント（IC）の寸法、およびヌクレオソームの配列を定量化した。

主な結果

• 分子同定と局在化： mH2A-eGFP-APEX2融合タンパク質は、LMおよびEMの両方においてXiのラベル化に成功した。著者らは、Xiが頻繁に核膜（NE）および核小体と関連していること、およびmH2Aのシグナルが目に見えるバール小体（高密度のDNAコア）を超えて広がっていることを確認した。これは、Xiがバール体よりも大きな染色体テリトリーであることを示唆している。
• クロマチン繊維の組織化：
  • 従来のETにおいて、Xi内のクロマチンは、幅4.5 nmから34.6 nm（中央値13.4 nm）の不規則な繊維やクラスターとして現れた。
  • クライオETは個々のヌクレオソームを解像し、それらが短い鎖、スタック、またはジグザグの形態をとっていることを明らかにした。
  • 極めて重要なことに、本研究では、Xiおよび常染色体領域のいずれにおいても、規則的な30 nm繊維や特定の高次ヘリカル構造の証拠は見つからなかった。これは、不規則で可変的なクロマチン配置のモデルを支持している。
• インタークロマチンコンパートメント（IC）の構造：
  • Xiは、より大きな「ラキュナ（空隙）」と小さなチャネルによって特徴付けられるICのネットワークを含んでいる。
  • これらのICラキュナには、しばしば直径約21 nmの球状の巨大分子集合体が含まれており、これらは機能的な複合体（例：スプライシング因子やXistフォーカス）を表している可能性がある。
  • ICネットワークは核孔から始まり、Xi全体に広がっていることが観察された。
• 緻密化と密度：
  • 「Xiは一様に高度に緻密化している」という仮定に反して、本研究では、クロマチン密度（ヌクレオソーム被覆率）は、Xi内のヘテロクロマチンドメインと常染色体領域のドメインとの間で有意な差はないことが判明した。
  • Xiの緻密化の増大は、ヌクレオソームレベルのパッキングがよりタイトであることではなく、ヘテロクロマチンドメイン間の距離が短縮し、それらがクラスター化していることに起因していると考えられる。
  • 常染色体領域のヘテロクロマチンは、Xiよりも核膜に近いことが判明しており、これは異なるアンカリング機構を示唆している。

意義と主張
本論文は、近原生な条件下で、個々のヌクレオソームレベルでの定義されたヘテロクロマチンドメイン（Xi）の最初の超構造的特性を明らかにしたものであると主張している。mH2A標識による分子特異性と高解像度クライオETを組み合わせることで、著者らは分子のアイデンティティと3次元構造を結びつける枠組みを確立した。

主な貢献は以下の通りである：

1. ICの解明： ICは欠落しているのではなく、特定のラキュナとチャネルからなるネットワークとして組織化されていることを示し、低解像度のデータに基づく従来の解釈に異を唱えた。
2. ネイティブな構造： クロマチンが、支配的な30 nm繊維構造を持たず、不規則で可変的な形態をとることを確認し、他の細胞種に関する最近の in situ 研究と一致する結果を示した。
3. 緻密化のメカニズム： Xiの独特な緻密化は、ヌクレオソームレベルのパッキング密度の固有の違いではなく、ドメインの空間的配置と近接性によって駆動されていることを提案した。
4. 手法の進展： 分子の同定と高解像度の構造生物学の間のギャップを埋める堅牢なCLEMワークフローを検証し、特定のクロマチン状態をそのネイティブな超構造に結びつける将来の研究を可能にした。

著者らは、これらの知見が、Xiは転写的に沈黙しマクロスコピックに緻密である一方で、複雑な内部組織（機能的なインタークロマチン空間を含む）を保持しており、その緻密化は一様な高密度化ではなくドメインのクラスター化の結果であるという理解を深めるものであると結論付けている。