Sarcomere length, fascicle length, and serial sarcomere number are preserved in paretic hindlimb muscles following chronic stroke in rats despite persistent motor impairment

問題
脳卒中は、筋力、協調性、および運動機能における持続的な障害を特徴とする、長期的な運動障害の主要な原因である。これらの欠損は一般に中枢神経系の制御の変化に起因するとされているが、骨格筋は神経活動、機械的負荷、および筋長の変化に応じて再構築される適応性の高い組織である。脳性麻痺（CP）のような小児疾患からのエビデスの示唆によれば、神経活動と機械的環境の慢性的な変化は、成長期におけるサルコメア生成（sarcomerogenesis）の阻害による、サルコメア長の増加および直列方向のサルコメア数の減少を特徴とする骨格筋の構造的再構築を誘発する可能性がある。しかし、すでに筋骨格系が成熟している成人発症の脳卒中において、同様の長期的な筋肉の適応が起こるかどうかは不明である。超音波を用いたこれまでのヒト研究では、麻痺側肢における筋束長（fascicle length）の短縮と直列方向のサルコメア数の減少が報告されているが、これらの知見は、画像診断の制約や、真の構造的再構築と測定上のアーチファクトまたは受動的な機械的条件を区別することの困難さによって制限されている。

方法論
本研究では、成体雌のSprague-Dawleyラットを用いた光血栓性脳卒中モデルを用い、慢性脳卒中がサルコメア長、サルコメア長分散、筋束長、または直列サルコメア数に影響を与えるかどうかを調査した。

• 被験者および誘導： 24匹の14週齢のラットを、脳卒中群（$n=17$）とシャム（偽手術）群（$n=7$）に無作為に割り付けた。脳卒中は、後肢感覚運動皮質を標的とした一側性の光血栓法により誘導した。可視的な病変が見られなかった脳卒中群の2匹を除外し、解析には15匹の脳卒中群と7匹のシャム群を用いた。
• 運動評価： 肢固有の運動障害を、テーパードビーム・トラバーサル課題を用いて縦断的に評価した。術後17週間（4.5ヶ月間）にわたり、毎週ミスステップ率を記録し、持続的な障害を確認した。
• 組織採取および組織学的解析： 術後18週目に動物を安楽死させた。脳を切断し、ニッスル染色を行い、病変の位置を確認した。麻痺側および非麻痺側両方の肢から、外側腓腹筋（LG）および長趾伸筋（EDL）を採取した。
• 筋肉の調製： 筋肉を固定し、硝酸を用いて結合組織を消化した後、グリセロールに移した。一貫した解剖学的部位から選択することを保証しながら、筋肉から筋束（fascicle bundles）を剥離した。
• 測定：
  • 筋束長： 単離された筋束を顕微鏡を用いて直接測定し、カスタムのMathematicaコードを使用して筋束の軌跡をデジタル化し、弧の長さを算出した。
  • サルコメア長および分散： 各筋束内の5箇所でレーザー回折を用いて定量化した。回折パターンの間隔から中央値としてのサルコメア長を算出し、一次ピークの幅から分散を決定した。
  • 直列サルコメア数： 測定された筋束長を中央値のサルコメア長で割ることにより算出した。
• 統計解析： 線形混合効果モデルを用い、グループ（脳卒中 vs シャム）、側（麻痺側 vs 非麻痺側）、筋肉の種類（LG vs EDL）、およびそれらの相互作用を考慮して、ビーム・トラバーサルのパフォーマンス、サルコメア特性、および筋束指標を分析した。

主要な貢献および結果
本研究は、制御された動物モデルにおいて、サルコメアおよび筋束の構造を直接かつ定量的に測定することで、従来のヒトの画像研究における限界に対処している。

• 運動障害： 脳卒中群は、持続的かつ肢固有の運動欠損を示し、4.5ヶ月間の回復期間を通じて、シャム群と比較して麻痺側肢において有意に高いミスステップ率を示した。
• サルコメア構造： CPの文献から導き出される仮説に反して、慢性脳卒中はサルコメア長やサルコメア長分散を変化させなかった。これらの指標において、脳卒中群とシャム群の間、および麻痺側と非麻痺側の間で有意な差は見られなかった。
• 筋束長および直列サルコメア数： 本研究では、脳卒中群において、シャム群よりも筋束長および直列サルコメア数が有意に大きいことが判明した。しかし、これらの差は肢特異的ではなかった（すなわち、麻痺側と非麻痺側の両方で発生した）。その結果、著者らは、これらの差は脳卒中による神経損傷に関連した特異的な適応ではなく、一般的なグループ効果を反映している可能性が高いと結論づけた。
• 筋肉の違い： すべての測定パラメータ（筋束長、サルコメア長、分散、および直列サルコメア数）において、LGとEDLの間で有意な差が観察された。これは、既知の構造的差異および固定された関節角度における相対的な筋長と一致している。

意義
本論文は、成人発症の脳卒中における持続的な神経学的欠損は、成熟した骨格筋におけるサルコメア長、サルコメア分散、筋束長、または直列サルコメア数の大幅な変化を必ずしも引き起こさないと主張している。この知見は、発達性疾患であるCPで見られる構造的適応とは対照的であり、神経損傷が発生するタイミングが、縦方向の筋肉の成長に関連する重要な要因であることを示唆している。著者らは、不完全なサルコメア生成は、能動的な骨格筋の成長期に神経損傷が発生することを必要とする可能性がある一方で、成人発症の脳卒中は筋骨格系がほぼ成熟した後に発生すると提案している。

さらに、持続的な運動欠損にもかかわらずサルコメア構造が保持されていることは、脳卒中に関連する筋肉の適応が、これらの指標では捉えられない他の構造的または機能的なスケール（例えば、筋肉量、線維型組成、あるいは筋内脂肪の変化など）で起こっている可能性を示唆している。本研究は、骨格筋の適応を解釈する際に、神経損傷のタイミング、重症度、および機械的な文脈を考慮することの重要性を強調しており、成人脳卒中モデルにおけるサルコメア再構築の欠如は、可塑性の欠如ではなく、成人期の筋骨格系特有の制約を反映している可能性を示唆している。