Disease investigation in a New Zealand high-health pig herd reveals a divergent porcine adenovirus

問題
豚アデノウイルス（PAdV）は、家畜豚の集団に遍在しているが、一般的には軽度の、あるいは無症候性の感染を引き起こす、主に自己限定的な下痢を伴う低病原性因子であると考えられている。5つの血清型が認識されているものの、ゲノムデータは限られており、これらのウイルスの真の進化的多様性と疾患能を不明瞭にしている。ニュージーランドでは、本調査以前、アデノウイルスによる封入体が偶発的な組織学的所見として時折見られることはあったものの、PAdVに関連する疾病アウトブレイクは報告されていなかった。本研究は、ニュージーランドにおける、320頭の母豚からなる高衛生・子宮摘出由来の豚群で発生した、原因不明の深刻な疾患アウトブレイクに対処するものである。このアウトブレックは、食欲不振、嗜眠、びまん性の皮膚紅斑、新生仔子豚の死亡、およびミイラ化した胎児の著しい増加を特徴としていた。臨床像は全身性のプロセスを示唆していたが、一般的な豚病原体に対する標準的な診断スクリーニングは大部分が陰性であったため、原因物質を特定するためのより広範な調査が必要となった。

方法論
本調査では、組織病理学、電子顕微鏡法、標的PCR、およびメタトランスクリプトミクスを組み合わせた包括的な診断アプローチを採用した。

• 試料採取: 臨床症状を示す未治療の仔豚（死後解剖のために安楽死させたもの）および複数のミイラ化した胎児から組織を採取した。試料には、組織学のためのホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織、および分子解析のための新鮮または冷凍組織が含まれる。
• 組織病理学および電子顕微鏡法: FFPE組織を検査し、核内封入体を観察した。影響を受けた細胞内のウイルス粒子を可視化するために、再処理されたパラフィンブロックに対して電子顕微鏡観察を行った。
• 標的PCR: 豚サーコウイルス（PCV）、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（PRRSV）、豚サイトメガロウイルス、豚パルボウイルス、およびテショウイルスを含む、繁殖障害や全身性疾患に関連する既知のウイルスパネルを用いて、qPCRおよびネステッドPCRによるスクリーニングを行った。また、汎アデノウイルス・ネステッドPCRも利用した。
• メタトランスクリプトミクス: 仔豚の組織（FFFE）および混合胎児組織から全RNAを抽出した。ライブラリはIllumina Stranded Total RNA Prepを用いて調製し、NovaSeqXプラットフォームでシーケンシングを行った。
• バイオインフォマティクス: リードのクオリティ・トリミングを行い、MEGAHITを用いてde novoアセンブリを行った。ウイルス配列は、NCBIの非冗長タンパク質データベースに対するDIAMONDのアライメントにより同定した。ウイルスの存在量は、リード数/百万（RPM）として定量化した。
• 系統解析: 保存されたDNAポリメラーゼ・タンパク質配列を、代表的なアデノウイルスと共にMAFFTを用いて整列させた。進化的な関係性を決定するために、最大尤度法を用いたIQ-TREEを使用して系統樹を構築した。

主な結果

• 病理: 仔豚の組織学的検査により、主に血管内皮細胞、マクロファージ、および間質細胞において、広範な核内封入体が認められた（腸、リンパ節、肝臓、腎臓、脾臓の複数の臓器）。電子顕微鏡により、これらの核内に40–70 nmの球状から六角形のウイルス粒子が存在することが確認され、これはアデノウイルス感染と一致する。
• ウイルスの同定: メタトランスクリプトミクス解析により、新規のアデノウイルス（暫定的にPorcine adenovirus 6、PAdV-6と命名）が、すべての仔豚組織ライブラリにおいて高い存在量（14,518–26,245 RPM）で同定された。このウイルスは、4つの胎児組織ライブラリのうち2つでも、より低い存在量ながら検出された。
• ゲノム特性: メタトランスクリプトミクス・データのde novoアセンブリにより、完全な27,685塩基対のゲノムが回収された。その多様性にもかかわらず、ゲノムは主要な構造遺伝子および複製遺伝子を含む、マスタデノウイルス（Mastadenovirus）の特徴的な構成を保持していた。
• 系統解析: PAdV-6は、既知のすべての豚アデノウイルスとは異なる、Mastadenovirus属内における明確な系統を形成した。既知のPAdV-3およびPAdV-5とは、アミノ酸同一性がわずか49–60%であった。最も近い一致は非豚宿主に見られ、具体的にはホッキョクグマアデノウイルス1（同一性63%）およびコウモリ・マスタデノウイルス（同一性63%）であり、高度に分岐した進化の歴史を示唆している。
• 共感染: 仔豚の腸管において、単一の低存在量の豚コブウイルス（Porcine kobuvirus）の検出が認められたが、その低存在量と既知の腸管または無症候性状態との関連性を考慮すると、主要な病原体である可能性は低いと判断された。PCV1およびPCV2は1つの胎児において少量検出されたが、観察された全身性の病理とは関連していなかった。

主な貢献
本研究は、ニュージーランドにおけるアデノウイルスに関連する最初の記録された疾患アウトブレイクを報告するものである。本研究は、PAdV-6という高度に分岐した系統を記述することにより、Mastadenovirus属の多様性を拡張し、豚アデノウイルスは均質な低病原性因子であるという仮説に疑問を投げかけるものである。また、標準的な標的診断が失敗する場合における、複雑な疾患アウトブレイクにおける新規病原体同定のためのメタトランスクリプトミクスの有用性を実証している。さらに、本研究は、豚における全身性アデノウイルス感染の詳細なゲノムおよび病理学的特性を明らかにし、このウイルスを深刻な繁殖および新生児疾患に結びつけている。

意義
本論文は、観察された疾患の深刻さは、おそらく高衛生な集団の免疫学的な未経験状態（免疫学的ナイーブ状態）によって引き起こされたものであると断じている。著者らは、PAdV-6は、既存の免疫を持つ従来の集団では検出されずに循環している可能性があるものの、特定の免疫を欠く集団に導入された場合には、深刻な全身性疾患および繁殖障害を引き起こし得ると示唆している。これらの知見は、これまで認識されていなかったアデノウイルス系統が、豚の疾患、特に高衛生な生産システムにおいて重要な寄与因子となり得ることを強調している。本研究は、宿主の免疫状態が疾患の結果を決定する上で重要であることを強調し、ウイルスの多様性と種間伝播のリスクを理解するために、国内の豚および共存する哺乳類におけるより広範なゲノム監視を求めている。著者らは、PAdV-6は繁殖疾患の認識不足の原因となる可能性が高いが、その病原性のポテンシャルが従来の集団においてどの程度であるかは、今後の監視および実験的研究を通じて完全に決定される必要があると結論付けている。