Circadian and Sex-Specific Responses to Alternaria alternata in Allergic Airway Inflammation

技術要約：アレルギー性気道炎症における Alternaria alternata に対する概日リズムおよび性差による応答

問題提起
喘息の重症度および免疫応答は概日リズムによって制御されることが知られており、症状や気道閉塞は通常、夜間または早朝にピークに達する。しかし、真菌抗原誘発性の気道炎症における概日タイミングの具体的な役割は、十分に定義されていない。臨床的に重要な真菌抗原であり、重症喘息の増悪や持続的な気道機能障害と強く関連している Alternaria alternata は、環境中の胞子数において日周変動を示す。それにもかかわらず、Alternaria 曝露に対する肺の応答が、時刻や生物学的性別によって影響を受けるのか、また、これらの要因が、特に STAT シグナル伝達および上皮バリアの完全性と関わる抗原駆動型の炎症経路とどのように相互作用するのかは不明である。

方法論
本研究では、成体 C57BL/6 野生型マウス（雌および雄、2〜3ヶ月齢）を用いた前臨床的な in vivo マウスモデルを採用した。実験デザインは、急性 Alternaria alternata (ALT) 喘息モデルであり、マウスに対して ALT 抽出物（10 µg）または PBS 対照を1日1回、4日間連続して経鼻投与した。曝露は、2つの異なる Zeitgeber 時間（ZT）で行われた：ZT0（06:00、休息相の開始）および ZT12（18:00、活動相の開始）。

主な評価手法は以下の通りである：

• 気道反応性 (AHR): 最終曝露の24時間後に、flexiVent システムを用い、メサコリン・チャレンジによって呼吸器系の抵抗、弾性、コンプライアンス、および組織減衰を測定した。
• 細胞解析: 気管支肺胞洗浄 (BAL) 液を回収し、フローサイトメトリーを用いて総細胞数および特定の免疫細胞集団（好酸球、好中球、マクロファージ、樹状細胞、ILC、および T 細胞）を定量化した。
• 組織病理学: 肺切片をヘマトキシリン・エオシン (H&E) 染色し、気管支周囲、血管周囲、および肺胞の炎症を半定量的にスコアリングした。
• 分子プロファイリング: BAL 液中のサイトカインおよびケモカインレベルをサイトメトリック・ビーズ・アレイで定量化した。肺組織については、概日時計構成要素（CLOCK、BMAL1、REV-ERRBα、PER2）、上皮接合タンパク質（E-カドヘリン、ZO-1、オクルディン、クローディン-4）、およびシグナル伝達分子（STAT1、STAT3、STAT6、ERK）の遺伝子発現（qRT-PCR）およびタンパク質レベル（ウェスタンブロット）を解析した。
• 統計解析: データは、Treatment（処置）、Sex（性別）、および Time（時間）の相互作用を評価するために、二元配置 ANOVA および一般化線形モデルを用いて解析された。

主要な貢献および結果
本研究は、Alternaria 誘発性のすべてのアレルギー性気道炎症が、概日タイミングと性別の両方によって制御されていることを示しており、明確な時間的および性的な二形性（性的二形）を明らかにしている。

1. 性特異的な時間的免疫浸潤:

   • 雌: 主に ZT0（休息相）において、好酸球、好中球、間質マクロファージ、および樹状細胞の浸潤が増強した。リンパ球集団（ILC2、Th2、Th17）も ZT0 でピークに達した。
   • 雄: 特に好酸球および樹状細胞において、ZT12（活動相）でより強い炎症反応を示した。
   • 総細胞数: 両性において ALT は総 BAL 細胞数を増加させたが、雄は休息相（ZT0）と比較して**活動相（ZT12）**において有意に高い細胞浸潤を示した。一方、雌にはこの特定の総細胞数の傾向は見られなかった。

2. サイトカインおよびケモカインプロファイル:

   • 雌: ZT12 において、より高いレベルの Th2 サイトカイン（IL-4、IL-5、IL-13）および炎症性/Th17 メディエーター（IL-6、TNFα、IL-17A、IL-22）を示した。
   • 雄: これらの同じメディエーターの最大誘導は ZT0 で認められた。
   • IL-33: 上皮性アラミンである IL-33 は、雌雄ともに ZT0 で有意に上昇していた。
   • 組織損傷マーカー: 乳酸脱水素素 (LDH) および尿酸レベルは、炎症性メディエーターと同じ概日依存的な傾向（雌では ZT12 で高く、雄では ZT0 で高い）に従った。

3. 気道反応性 (AHR):

   • 機能面では、ALT 曝露を受けたマウスは、**休息相（ZT0）**においてより大きな AHR（抵抗、弾性、および組織減衰の増加、ならびにコンプライアンスの低下）を示した。
   • この効果は主に雄によって引き起こされており、雄は AHR において顕著な時刻依存的な変動を示した。雌は、顕著な炎症反応を示すにもかかわらず、気道力学における日周変動は最小限であり、炎症と機能的閉塞との間の性特異的なデカップリング（非連動）を示唆している。

4. 上皮バリアおよび概日時計の乱れ:

   • バリアの完全性: ALT 曝露は、上皮接合タンパク質（E-カドヘリン、ZO-1）を破壊した。雌では、特に ZT0 において ZO-1 および E-カドヘリンが減少した。雄では、コントロールでは ZT0 において ZO-1 レベルが高かったが、ALT 曝露により ZT0 でさらに増加した。
   • 時計タンパク質: ALT 曝露は、中核となる概日タンパク質の発現を変化させた。雌では、CLOCK および BMAL1 が両方の時点（ZT0 および ZT12）で減少しており、REV-ERRBα は ZT12 で低かった。雄では、CLOCK および BMAL1 が ZT12 で減少し、REV-ERRBα は ZT0 と比較して ZT12 で著しい減少を示した。
   • シグナル伝達経路: 炎症のピークは、雌雄ともに ZT0 における STAT1、STAT3、および STAT6 の活性化（リン酸化）の亢進と一致していた。ERK1/2 のリン酸化は性特異的なパターンを示し、雄では ZT0 で増加したが、雌では減少した。

意義および主張
著者らは、本研究が、真菌抗原誘発性の気道炎症の決定因子として、概日タイミングと性別を特定したと主張している。Alternaria 特異的な STAT 依存性経路および炎症経路の「概日ゲーティング（時次的制御）」を定義することで、本研究は、抗原駆動型の気道応答の経時的な調節に関する新たな知見を提供している。

本論文は、概日時計構成要素と抗原駆動型経路との相互作用は双方向であると仮定している。すなわち、真菌抗原は肺の概日リズムを撹乱し（CLOCK/BMAL1/REV-ERRBα の変化）、これが免疫および上皮応答に影響を与える。これらの知見は、**時間療法（クロノセラピー）**的アプローチ、すなわち時刻および生物学的性別に基づいた介入を行うことが、特に重度の真菌抗原駆動型喘息の転帰を改善する可能性があることを示唆している。また、本研究は、Alternaria に対する反応がハウスダストマイト（HDM）抗原に対する反応とは大きく異なることを強調しており、喘息管理における抗原特異的な生物学的時計の考慮の必要性を浮き彫りにしている。