Prior Bombyx mori latent virus exposure alters subsequent BmNPV infection in the silkworm, B. mori

技術要約：カイコにおける既往のBombyx mori潜伏ウイルス曝露による、その後のBmNPV感染への影響

問題提起
動物は頻繁に複数の病原体に遭遇しており、感染歴がその後の感染の結果に影響を与えることは知られている。先行するウイルス曝露が昆虫において抵抗性を高めることもあれば、感受性を高めることもあるが、鱗翅類における持続的なRNAウイルスがその後のDNAウイルス感染に与える具体的な影響については、いまだ十分に理解されていないのではない。Bombyx mori潜伏ウイルス（BmLV）は、持続的なプラス鎖単鎖RNAウイルスであり、B. mori核多角体ウイルス（BmNPV：DNAバキュロウイルス）と相互作用することが知られている。しかし、BmLVへの曝露（特に、明らかな疾患を引き起こさない程度の曝露）が、その後のBmNPVの増殖、レポータータンパク質の発現、あるいはカイコの抗ウイルス応答をどのように変化させるのかは不明である。

方法論
本研究では、培養昆虫細胞と第五齢カイコ（系統n22およびf38）の両方を用いた比較アプローチを採用した。

• 細胞培養モデル： BmMAX7050np細胞（BmLVフリー）を用い、以下の3つの条件を設定した。(1) 持続的なBmLV感染（80〜100継代まで維持）、(2) 短期間のBmLV曝露（BmNPV感染の24時間前）、(3) 同時共感染。これらの細胞に対し、リコンビナントBmNPV（ホタルルシフェラーゼ（Luc）または強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現）を感染させた。
• 幼虫モデル： 第五齢幼虫に対し、BmLV接種液をBmNPVへのチャレンジの24時間前に血腔内注入（事前曝露）、または同時共感染を行った。対照群には、BmNPV単独感染、および模擬注入（mock injection）を用いた。
• 定量的解析：
  • ウイルス量： BmNPV DNAポリメラーゼ遺伝子を標的としたqPCRにより、培養上清、無細胞血リンパ、および各組織（血球、脂肪体）におけるBmNPVゲノムの存在量を定量化した。
  • レポーター発現： BmNPVによる遺伝子発現を評価するため、ルシフェラーゼ活性を測定した。
  • 複製確認： ストランド特異的RT-PCRを用い、各種幼虫組織におけるBmLV抗原ゲノムRNA（マイナス鎖）を検出し、入力されたゲノムRNAと能動的な複製を区別した。
  • 宿主応答： 主要な抗ウイルス遺伝子の転写レベル（RNAi経路のDicer-2, R2D2, Ago2、およびSTING依存性NF-κBシグナル伝達のSTINGおよびRelish）を、脂肪体および血球組織においてRT-qPCRにより解析した。

主な結果

1. BmLVの文脈依存的な影響：

   • 培養細胞において： 持続的なBmLV感染は、BmLVフリーの細胞と比較して、BmNPVゲノム量およびルシフェラーゼ発現を有意に増加させた。しかし、短期間のBmLV曝露（24時間の事前曝露または同時共感染）ではこの増強効果は再現されなかった。このことは、細胞における効果が持続的な感染状態の確立に依存していることを示唆している。
   • 幼虫において： ダイナミクスは異なった。24時間のBmLV事前曝露は、n22およびf38の両系統において、BmNPVゲノムの蓄積およびルシフェラーゼ発現を有意に増強した。この効果は、BmNPV単独感染群または同時共感染群では観察されず、個体レベルの文脈においては曝露の時系列が極めて重要であることを示している。

2. 幼虫におけるBmLVの複製：

   • ストランド特異的RT-PCRにより、BmLV接種の24時間後において、複数の幼虫組織（中腸、絹腺、血球、脂肪体、精巣）でBmLV抗原ゲノムRNAが確認された。これは、明らかな死亡や形態学的異常がない状況下でも、BmLVが幼虫内で活発に複製している証拠である。

3. 抗ウイルス遺伝子誘導の減衰：

   • その後のBmNPV感染に続き、BmLV事前曝露を受けた幼虫では、対照群と比較して、脂肪体における特定の抗ウイルス遺伝子の誘導が有意に減少した。具体的には、事前曝露群においてDicer-2、R2D2、およびSTINGの転写レベルが低下していた。
   • 血球においては、抗ウイルス遺伝子誘導の減衰はそれほど顕著ではなかったが、BmNPV感染後48時間においてSTINGの発現が事前曝露群で顕著に高かった。
   • 脂肪体における抗ウイルス遺伝子誘導の減少は、当該組織におけるBmNPVゲノム量の増加と一致していた。

意義および主張
著者らは、本研究が、連続するウイルス感染がどのようにカイコの宿主・ウイルス相互作用を形成するかについての理解を広げるものであると主張している。主な知見は以下の通りである：

• 持続的なRNAウイルス（BmLV）への事前の曝露は、その後のDNAウイルス（BmNPV）の増殖を促進し得る。
• この増強は、脂肪体におけるRNAiおよびSTING経路の構成要素を含む、宿主の抗ウイルス遺伝子誘導の減衰に関連している。
• 生物学的文脈（培養細胞 vs 個体幼虫）および感染の時系列的関係（持続感染 vs 短期事前曝露）が、相互作用の結果を決定する重要な要因である。

本論文は、BmLVの存在がウイルス複製やタンパク質収量を意図せず変化させる可能性があるため、BmLVの曝露歴がバキュロウイルスを用いた組換えタンパク質発現システムに影響を与える可能性があることを示唆している。結論として、感染歴は、明らかな疾患の有無にかかわらず、その後のウイルス感染の結果を形作る可能性があることを示しており、事前のウイルス曝露によって確立される宿主の生理学的状態の複雑さを浮き彫りにしている。