技術要約：Fungal-DBiTによる空間解像度を持つ宿主–真菌トランスクリプトーム・プロファイリング

問題提起

侵襲性真菌感染症は世界的に重大な健康負荷をもたらしているが、哺乳類組織内における真菌の生態学的ダイナミクスは依然として十分に解明されていない。既存のマイクロバイオームおよびトランスクリプトーム解析手法は、通常、真菌コミュニティをバルク（一括）でプロファイリングするため、空間的な組織化や局所的な宿主応答を不明瞭にしてしまう。逆に、イメージングベースの手法は分子レベルの深みに欠けることが多い。空間トランスクリプトミクスは宿主–病原体相互作用のための変革的なツールとして台頭しているが、現在の技術は主に哺乳類細胞に最適化されており、真菌のために体系的に適応されてはいない。特に、真菌の細胞壁の硬さやRNAキャプチャの非効率性といった技術的障壁が、真菌生物学への空間トランスクリプトミクスの適用を妨げてきた。その結果、真菌の空間的微細構造、真菌負荷の不均一性、および感染時における局所的な宿主免疫アーキテクチャは、ほとんど特徴付けられていない。

手法：Fungal-DBiT

これらの限界に対処するため、著者らは真菌生物学に特化して最適化された空間トランスクリプトミクスプラットフォームであるFungal-DBiT（決定論的組織内バーコーディングによる真菌解析）を開発した。このワークフローは、標的とする真菌細胞壁の透過処理と、直交するマイクロ流体バーコーディングを統合しており、無傷の組織切片内において、宿主および真菌のRNAを同時かつ高解像度でマッピングすることを可能にする。

実験ワークフロー:

1. 組織調製: 新鮮凍結組織切片をパラホルムアルデヒドで固定する。
2. 細胞壁の透過処理: 重要なステップとして、Zymolyase（DTTおよびTriton X-100を併用）を用いた酵素消化を行い、真菌細胞壁を除去してRNAへのアクセスを容易にした後、Triton X-100を用いて組織を透過させる。
3. 逆転写 (RT): 組織切片上でin situにて逆転写を行う。
4. 直交バーコーディング: 2段階の逐次的なマイクロ流体バーコーディングにより、垂直方向の配向を通じて空間バーコードAおよび空間バーコードBをライゲーションによって導入する。これにより、転写産物レベルで2次元の空間座標とユニーク分子識別子（UMI）を符号化する。
5. ライブラリ調製: バーコード化されたcDNAを組織溶解によって放出し、精製および増幅を行う。ライブラリはIllumina NovaSeqプラットフォームでのシーケンシング用に調製される。
6. 計算パイプライン: 専用のパイプラインを用いて、品質管理、宿主（マウス）および真菌のリファレンスゲノムへのデュアルアライメント、リード分類、および空間カウント行列の生成を行う。

モデル系:
本プラットフォームは以下のモデルを用いて検証された：

• 感染マウスモデル: 定義された7種の真菌混合物（Candida parapsilosis, C. glabrata, C. albicans, C. tropicalis, Aspergillus fumigatus, A. niger, C. krusei）を接種した免疫抑制マウス。心臓および腎臓組織を50 µmおよび25 µmの解像度でプロファイリングした。
• 生理的なマウス腸管: 健康なマウスの小腸をスイスロール法により作成し、明らかな炎症のない状態での低存在量真菌コミュニティをプロファイリングした。

主な貢献

• 真菌のための初のマイクロ流体空間プラットフォーム: Fungal-DBiTは、物理的な分離を必要とせずに、宿主および真菌細胞の両方からゲノムワイドな遺伝子発現をin situでデュアルプロファイリングできる、初のマイクロ流体ベースの空間トランスクリプトミクスプラットフォームである。
• 最適化された透過処理: Zymolyaseによる細胞壁除去の統合は、複雑な哺乳類組織内における硬い真菌細胞からのRNAキャプチャという技術的課題を特異的に解決している。
• 種解像度の空間マッピング: 本手法は、複数の真菌種とその特異的な宿主転写状態との相互作用を、同時に検出および空間的にマッピングすることを可能にする。

結果

1. 感染心臓組織における概念実証（50 µm 解像度）

• 空間的不均一性: Fungal-DBiTは、顕著な真菌定着の空間的不均一性を明らかにした。真菌RNAは一様に分布しているのではなく、離散的な領域で検出された。
• 宿主–真菌の逆相関関係: 真菌量が高い領域では、宿主UMIカウントが著しく減少しており、これは真菌による宿主細胞の消失（アポトーシス／組織損傷）と一致している。これは18S rRNA FISHおよびH&E染色によって検証された。
• クラスター解析: 非教師ありクラスタリングにより、「感染コア」（クラスター5）と「感染周辺部」（クラスター4）が特定された。コアは骨髄系細胞マーカーが豊富であり、周辺部はミトコンドリアおよび収縮関連遺伝子（例：mt-Atp6, Cox1, Ttn）の発現低下と、核調節遺伝子（Cmss1, Cdk8）の濃縮を示した。
• 種組成: C. albicansが主要な種であり、50 µm解像度のデータセット全体で真菌UMIの**74.4%**を占め、離散的な高密度領域を形成していた。他の種（C. glabrata, C. krusei, A. niger）はより低い存在量で存在していた。
• 相関: Candida属の種の間には強い正の空間相関が見られ、共通のニッチを示唆していた。一方で、Aspergillus属は異なるパターンを示した。宿主遺伝子発現（例：Tnnt2, Myh6）は、真菌負荷の四分位数に応じて有意に変化した。

2. 高解像度プロファイリング（25 µm）

• 25 µmチップを使用することで、スポットあたり最大約300個の真菌UMIを持つ局所的な過成長ホットスポットを解明した。
• C. albicansは感染コア領域において依然として優占していたが、この高解像度データセットでは全真菌UMIの**58.7%*を占めており、他のCandida*種はより拡散した分布を示した。
• 高解像度データは、真菌が豊富な領域と宿主の炎症遺伝子発現との間の局所的な関連性を裏付けた。

3. 感染腎臓組織

• 腎臓における真菌感染は心臓よりも広く分布しており、宿主と真菌のUMI分布の間に強い逆相関関係は見られなかった。
• 免疫応答: 真菌負荷が高いスポットでは、骨髄系および自然免疫マーカー（Ms4a1, Ighg1, Lgals3, Cxcl2, Ccl7）および抗原提示遺伝子（H2-D1, Cd80, Cd86）の顕著なアップレギュレーションが認められ、段階的な免疫応答の連続性を示した。
• 種分布: C. albicansが優占（真菌UMIの87.4%）しており、Candida属の種間には強い空間的共起が見られた。

4. 生理的な腸管組織

• 健康なマウス腸管に適用したところ、Fungal-DBiTは、連続的な感染コアではなく、散在するマイクロドメインに限定された低存在量の真菌シグナルを検出した。
• 多様性: 感染組織とは異なり、単一の真菌種が全真菌UMIの70%を超えることはなかった。SaccharomycesおよびCandidaに関連するシグナルが優占しており、S. pombeが他の分類群とともに主要な構成要素として特定され、生理的条件下でのよりバランスの取れたコミュニティ構造を反映していた。
• ニッチの組織化: 2つの離散的な空間的真菌ニッチが特定された。これらは同様の種組成を示したが、局所的な種の優占度には変動があり、健康な状態においても組織化された微小環境が存在することを示唆していた。

5. 再現性と検証

• 再現性: 宿主転写物（R = 0.980）、真菌転写物（R = 0.984）、および結合データセット（R = 0.981）において、生物学的レプリケート間で高い相関が観察された。
• 検証: 空間トランスクリプトームデータは、バルクRNA-seq（r = 0.847）および一致するパターンを示す18S rRNA FISH染色と強い一致を示した。

意義と主張

著者らは、Fungal-DBiTが、宿主–真菌相互作用、多種混合感染、および真菌病原性をin situで研究するための汎用的なフレームワークを提供すると主張している。宿主および真菌のトランスクリプトームを同時に空間解像度を持ってプロファイリングすることを可能にすることで、本プラットフォームは、真菌の定着が高度に局在化しており、それが明確に空間的に限定された宿主の転写再構成（代謝再プログラミングや免疫浸潤を含む）を伴っていることを明らかにした。これは、バルク解析や非空間的アプローチでは見過ごされてしまう現象である。

論文では、Fungal-DBiTを、物理的な細胞分離を必要とせずに、ネイティブな宿主–真菌の空間的関係を保持できる、スケーラブルでコスト効率の高いツールとして位置づけている。スポットの集積による単一真菌解像度の制限についても認めているが、著者らは、本研究が空間解像度を持つ真菌生物学研究のための基礎的能力を確立し、組織に存在する真菌の役割、すなわち健康、感染、および炎症性疾患の研究に新たな道を開くものであると主張している。