Viral subversion of the host ubiquitin proteasome system is broadly sensed by the NLRP1 inflammasome

技術要約：ウイルスによる宿主ユビキチン・プロテアソーム系の攪乱は、NLRP1インフラマソームによって広く感知される

問題と背景
自然免疫は、病原体関連分子パターン（PAMPs）を検出するパターン認識受容体（PRRs）と、病原体の毒性因子による酵素活性を感知するエフェクター誘発免疫（ETI）に依存している。NLRP1インフラマソムは、「機能的分解（functional degradation）」と呼ばれるメカニズムを介して、細菌のプロテアーゼ（例：Bacillus anthracisの致死因子）やE3リガーゼ（例：Shigella flexneriのIpaH7.8）を検出することが知られているが、哺乳類のNLRP1オーソログがウイルスのE3リガーゼ活性をどの程度感知するかについては未定義であった。多くのウイルスは、複製を容易にするために、E3ユビキチンリガーゼをコードしているか、あるいは宿主のCullin-RINGリガーゼ（CRL）複合体をハイジャックしてインターフェロン調節因子（IRFs）などの抗ウイルス宿主タンパク質を分解する。著者らは、この宿主ユビキチン・プロテアソーム系に対するウイルスの攪乱が、NLRP1インフラマソム活性化の保存されたトリガーとして機能しているかどうかを調査した。

方法論
本研究では、ウイルスのE3リガーゼ活性をスクリーニングするために、高スループットの分裂ルシフェラーゼレポーターシステム（ASC-luc）を用いた。

• レポーターシステム: 著者らは、ヒトASCにNanoLucルシフェラーゼの「Large BiT」（LgBit）または「Small BiT」（SmBit）断片をそれぞれ融合させた二シストロン性ベクターを設計した。インフラマソムの集合はASCのオリゴマー化を誘導し、ルシフェラーゼ活性を再構成する。
• スクリーニングライブラリ: E3リガーゼ、E3リガーゼアダプター、またはマスターレギュレーターをコードする81種類のウイルスのオープンリーディングフレーム（ORF）を含むライブラリを、野生型（WT）ヒトNLRP1、FIINDプロセシング欠損変異体（S1213A）、または空ベクターを共発現させたHEK293T細胞を用いてスクリーニングした。
• 検証とメカニズム: トップヒットは、IL-1β分泌アッセイ（HEK-BLUEレポーター）、pro-IL-1βプロセシング（p17）のウェスタンブロッティング、およびASCスペック形成の顕微鏡観察によって検証された。メカニズム研究には以下が含まれる：
  • ウイルスE3リガーゼの変異導入（例：RINGドメイン変異体、C末端欠失）。
  • プロテアソーム（MG-132）およびCRL活性化（MLN4924）による薬理学的阻害。
  • ウイルス変異体（例：$\Delta$NSP1 rotavirus）およびdsRNAセンシング経路変異体（MDA5、PTSTAVL欠損NLRP1）の使用。
• オーソログスクリーニング: ウイルスE3活性の感知および特異性を評価するため、11種類の哺乳類NLRP1オーソログ（非ヒト霊長類、齧歯類、その他の哺乳類を含む）のパネルに対してスクリーニングを拡張した。ヒトとギボン由来のNLRP1間のキメラ構築物を用いて、感知決定因子をマッピングした。

主な結果

1. NLRP1活性化因子としてのNSP1の同定: スクリーンにより、simian rotavirus SA11（RVSA11）の非構造タンパク質1（NSP1）が、ヒトNLRP1インフラマソムの強力な活性化因子であり、20倍以上のルシフェラーゼ活性を誘導することが明らかになった。この活性化はNLRP1のFIINDプロセシングに依存していた（S1213A変異体は活性化に失敗した）。また、テストされたオーソログの中で、ヒトNLRP1に対して特異的であった。
2. 活性化メカニズム: RVSA11 NSP1によるNLRP1の活性化には、そのRINGドメインE3リガーゼ活性が必要である。NSP1の発現はNLRP1のN末端部分の分解（機能的分解）を引き起こし、C末端のUPA-CARD断片を遊離させてインフラマソムを形成する。このプロセスは、宿主のプロテアソームおよびCRL機構に依存しており、阻害剤MG-132およびMLN4924によって活性化がブロックされた。
3. 感染コンテキスト: RVSA11感染中、ヒトNLRP1はNSP1依存的に活性化される。RVSA11感染はdsRNAセンシング（MDA5およびPTSTAVLモチーフに依存）によってもNLRP1をトリガーするが、NSP1依存性経路はこれらのモチーフとは独立して機能する。
4. 構造的決定因子:
   • ウイルス側: NSP1のC末端ドメイン（CTD）がNLRP1の活性化を決定する。IRF3分解に必要なpLxISモチーフはNLRP1活性化には不要であるが、CTD（残基321–386）内の特定のアミノ酸（L334、S335）が極めて重要である。RVSA11と、非活性化型のヒトロータウイルス株（RVB10）の間でこれらの残基をスワッピングすることで、NLRP1活性化能力が付与された。
   • 宿主側: NLRP1のNACHTドメイン、特にHD2サブドメインが種特異的な感知を規定する。ヒトのNACHTドメイン（または特にHD2サブドメイン）をギボンのNLRP1にスワッピングすることで、RVSA11 NSP1に対する感受性が付与された。
5. 広範かつ特異的な感知: 11種類の哺乳類NLRP1オーソログに対してウイルスE3ライブラリーを用いたスクリーニングの結果、ウイルスE3活性の感知は哺乳類全体で広く保存されていることが示された（ほとんどのオーソログが少なくとも一つのウイルスE3に反応した）。しかし、その相互作用は極めて特異的である。各オーソログはテストされたエフェクターのわずか〜1–3%のみを認識し、ほとんどのウイルスE3は単一のNLRP1オーソログのみを活性化した。

意義と主張
本論文は、ウイルスのE3ユビキチンリガーゼ活性の検出が、NLRP1インフラマソムによって用いられる、ウイルス感染を検知するための保存された戦略であることを確立したと主張している。著者らは、NLRP1が「ガード（守護者）」として機能し、宿主タンパク質のウイルスによるアンタゴニズム（具体的には、ウイルスE3リガーゼによる宿主標的の分解）を逆手に取って、自身のN末端分解とそれに続くインフラマソム活性化を誘発するというモデルを提案している。これは、病原体に対する哺乳類の防御レパートリーを拡大する、エフェクター誘発免疫の一形態である。本研究の結果は、E3リガーゼ活性を感知する「能力」は保存されているものの、ウイルスエフェクターと宿主NLRP1オーソログの具体的な「組み合わせ」は、共進化の圧力によって高度に種特異的かつウイルス特異的であることを強調している。本研究は、このメカニズムがすべてのロータウイルス感染における主要な防御であるとは主張していない（RVSA11は霊長類ウイルスであり、テストされたヒトロータウイルスはヒトNLRP1を活性化しなかったことを注記している）。むしろ、これまで認識されていなかった抗ウイルス免疫のメカニズムを特定したものである。