The study of O-GalNAcylation repair on MUC2 and E-cadherin of intestinal epithelial cells damaged by lipopolysaccharides

技術要約：リポ多糖質によって損傷した腸管上皮細胞におけるMUC2およびE-カドヘリンのO-GalNAc修飾（O-GalNAcylation）の修復に関する研究

問題提起
腸粘膜バリアは、細菌エンドトキシン、特にグラム陰性菌由来のリポ多糖質（LPS）に対する主要な防御壁として機能している。ムチン2（MUC2）は粘液層の主要成分であり、接着結合（adherens junctions）を修復し、LPSの透過性を減少させることが示されている。しかし、LPS誘発性のストレス下において、MUC2がどのような分子メカニ خلالで接着結合の構造を修復するのか、その詳細なメカニズムは依然として不明である。具体的には、LPSがMUC2およびE-カドヘリンのO-糖鎖修飾にどのように影響を与えるのか、また、これらの糖鎖修飾パターンを回復させることが腸管バリアの修復につながるのかどうかが解明されていない。

方法論
本研究では、ヒトの腸内環境を模倣するために、Caco-2（腸管上皮細胞）とHT-29（ゴブレット細胞）の共培養モデルを用いた。実験デザインは以下の通りである：

• LPS処理： バリア損傷を誘導するため、細胞を異なる時間（24〜72時間）LPSに曝露させた。
• 遺伝子操作：
  • 過剰発現： O-GalNAc修飾を開始する主要な糖転移酵素であるGalNT3を過剰発現させるためのプラスミドを細胞に導入した。
  • サイレンシング： バリア修復におけるMUC2の必要性を評価するため、siRNAを用いてMUC2をサイレンシングした。
• 分析技術：
  • 透過型電子顕微鏡（TEM）： 超微細構造の変化、特に小胞体（ER）の膨張および空胞化を可視化した。
  • ウェスタンブロッティングおよびqPCR： MUC2、E-カドヘリン、タイトジャンクションタンパク質（ZO-1、Claudin、Occludin）、および糖転移酵素（GalNT3、B3GNT6など）のタンパク質およびmRNAレベルを定量化した。
  • 質量分析（MSFragger-Glyco）： 包括的なO-糖タンパク質プロテオミクスを用い、MUC2およびE-カドヘリン上の特定のO-糖鎖構造（例：HexNAc、Core-3、Core-4）の変化を同定した。
  • 共免疫沈降法（Co-IP）および構造モデリング： MUC2とE-カドヘリンの物理的な相互作用を確認し、AlphaFold2およびSWISS-MODELを用いて結合界面を予測した。
  • カルシウムアッセイ： 細胞内Ca²⁺濃度およびカルシウム調節因子（STIM1、Orai1、IP3R、PMCA4、SERCA）の発現量を測定した。
  • RNA-seqおよび機能的濃縮解析： 差発現遺伝子を解析し、それらをKEGGパスウェイ（例：接着結合、カルシウム結合EGFドメイン）および遺伝子オントロジー（GO）用語にマッピングした。

主な結果

1. LPS誘発性の損傷メカニズム： LPS処理は、腸管上皮細胞における顕著な小胞体（ER）の膨張と空胞化を引き起こした。この損傷は、GalNT3およびB3GNT6のダウンレギュレーションと相関しており、MUC2における長鎖O-糖鎖の喪失およびHexNAc含有O-糖鎖の存在量の減少をもたらした。対照的に、LPSストレス単独によるE-カドヘリンのO-糖鎖修飾への影響は最小限であった。
2. MUC2-E-カドヘリン相互作用： Co-IPおよび構造モデリングにより、MUC2（中央領域、アミノ酸1000–1500）とE-カドヘリン（N末端領域、アミノ酸0–500）の間の直接的な物理的相互作用が確認された。
3. GalNT3過剰発現による回復： LPS処理された細胞においてGalNT3を過剰発現させると、MUC2のO-糖鎖スカフォールド（骨格）が回復した。これには、長鎖O-糖鎖（特にCore-3およびCore-4構造）の再付加と、HexNAc含有量の増加が含まれる。E-カドヘリン自身の糖鎖修飾は大部分変化しなかったが、そのタンパク質発現レベルが増加し、MUC2と共局在することで、より強固な細胞クラスター形成をもたらした。
4. カルシウムおよび接着結合経路： 修復メカニズムは細胞内カルシウム恒常性と関連していた。GalNT3の過剰発現は、カルシウム結合タンパク質および因子（STIM1、Orai1、IP3R1/3、PMCA4、SERCA2b）の発現をアップレギュレートした。これにより、E-カデリンのCa²⁺依存的なホモフィリックな接着に不可欠な細胞内Ca²⁺レベルが回復した。
5. バリア機能： 回復したMUC2のO-糖鎖修飾と強化されたE-カドヘリン結合の二重の作用により、FITC-LPSの取り込み減少によって示されるように、細胞内へのLPS透過が有意に減少した。

意義および主張
本論文は、LPSが小胞体におけるMUC2の初期段階のO-GalNAc修飾を阻害することによって、腸管バリアを損傷するという特定の分子経路を解明したと主張している。本研究は、このバリアの修復は単なるMUC2分泌の増加による結果ではなく、特にそのO-GalNAc糖鎖スカフォールドの回復に依存していることを提示している。

著者らは以下の通り主張している：

• GalNT3は重要な調節因子であり、これを過剰発現させることで、LPS誘発性のMUC2糖鎖欠損を逆転させることができる。
• 回復したMUC2 O-糖鎖は、E-カドヘリンとの相互作用を促進し、それによって接着結合を強化する。
• このプロセスは、カルシウム結合EGFドメインを介し、E-カデリンの機能に不可欠な細胞内Ca²⁺恒常性の維持を通じて行われる。
• 本研究は、O-GalNAc糖鎖修飾とカルシウムシグナル伝達を標的とすることで、腸管粘膜バリア機能不全を治療するための新しい研究方向を提供しており、微生物叢を乱さない潜在的な治療候補を提示している。

これらの知見は、健康なムチンがいかにして細菌の病原性を減衰させるか、そしてMUC2とE-カデリンの「二重の作用」がいかにしてエンドトキシン透過による細胞損傷を共同で軽減するかというメカニズムを説明するものである。