Haplotype-resolved PacBio HiFi genome assemblies of the olive cultivar ‘Picual’

技術要約：オリーブ品種「ピクアル」におけるハプロタイプ分解されたPacBio HiFiゲノムアセンブリ

問題提起
オリーブ（Olea europaea L.）は、特に地中海地域において極めて重要な経済的価値を持つ作物である。しかし、そのゲノム研究は、この種固有の複雑さによって阻まれてきた。オリーブゲノムは、高いヘテロ接合性と広範な構造変異、そして過去の古代全ゲノム重複（WGD）イベントの歴史を特徴としている。広く利用されている「ピクアル」リファレンス（Oleur0.6.1）を含む従来のゲノムアセンブリは、コンセンサス配列化手法に依存していた。これらの手法は、ヘテロ接合性のバリアントを単一のハプロタイプへと崩壊（collapse）させてしまい、アレル変異やゲノムの真の複雑性に関する重要な情報を事実上消失させてしまう。この制限は、オリーブのような高度にヘテロ接合的な種においては特に致命的である。なぜなら、クローン増殖によって多様なヘテロ接合の組み合わせが数千年にわたって維持されてきたからである。したがって、種のゲノム構造を正確に捉え、ゲノミクス支援育種を促進するためには、個々のハプロタイプを分解・解明したアセンブリが必要とされている。

手法
著者らは、Pacific Biosciences (PacBio) High-Fidelity (HiFi) シーケンシングを用い、「ピクアル」品種の染色体レベルのハプロタイプ分解されたゲノムアセンブリを構築した。

• 試料調製: スペインのコルドバにある世界オリーブ生殖質コレクションで維持されている「ピクアル」の樹木から得られた葉組織より、高分子量（HMW）ゲノムDNAを抽出した。DNAの完全性は、Agilent BioanalyzerおよびFemto Pulseシステムを用いて厳格に評価された。
• シーケンシング: 4つのSMRTセルをPacBio Sequel IIeプラットフォーム上で、最小予測精度閾値Q20のCircular Consensus Sequencing (CCS) を用いてシーケンシングした。これにより、7,787,395本のHiFiリードが得られ、35.5倍のシーケンシング深度を達成した。
• アセンブリ戦略:
  • コンセンサス・アセンブリ: 生リードをHifiasm (v0.19.8) を用いて de novo でアセンブリし、プライマリ・コンセンサスゲノムを生成した。その後、'Arbequina'ゲノムをリファレンスとしてRagTag (v2.1.0) を用い、染色体レベルへのスキャフォールディングとポリッシングを行った。
  • ハプロタイプ分解: 同じHifiasmパイプラインを用いて、生リードから直接2つのハプロタイプ（Haplotype 1およびHaplotype 2）を分離した。コンタミ（汚染）コンティグはBlobtoolsを用いて除去し、重複配列はPurge_dupsを用いて排除した。
• アノテーションおよび解析:
  • 反復配列要素: RepeatModeler2およびTESorterを用いてカスタムライブラリを作成し、RepeatMaskerおよびEarlGreyを用いてソフトマスキングを行った。
  • 遺伝子予測: 構造アノテーションには、様々な組織からのRNA-seqデータおよびUniProt/Swiss-Protからのタンパク質配列を用いた、ab initio法とエビデンスに基づく手法（BRAKER3パイプライン）を使用した。
  • ハプロタイプ転送: コンセンサス・アセンブリから得られた遺伝子アノテーションを、Liftoffを用いてハプロタイプ特異的アセンブリへと転送した。
  • 発現解析: 異なるアレル特異的発現を評価するため、複数の「ピクアル」器官からのRNA-seqデータを各ハプロタイプに対して独立してマッピングした。

主な結果

• アセンブリの品質: コンセンサス・アセンブリ（OleurPic101と命名）は、1.24 Gbpの範囲をカバーし、N50は45.8 Mbp、L50は11である。これは23本のウルトラロング・スキャフォールドを含む395個のフラグメントで構成されており、これらはオリーブの全染色体に対応している。これは、従来の「ピクアル」アセンブリ（Oleur0.6.1）と比較して、連続性が111倍向上していることを示す。BUSCO解析によれば、遺伝子の完全性は97.9%である。
• ハプロタイプ・アセンブリ: 分解された2つのハプロタイプ（H1およびH2）は、総スキャフォールド長がそれぞれ1.25 Gbpおよび1.20 Gbpであり、L50はそれぞれ12および11、最大スキャフォールド長はそれぞれ86.3 Mbpおよび80.6 Mbpであった。ハプロタイプあたりのカバレッジ減少により、コンセンサスよりもやや断片化しているものの、これらのアセンブリは真正なハプロタイプ特異的配列を保持している。K-merスペクトル解析により、コンセンサス・アセンブリではk-mer多様性の75%しか捉えられていなかったのに対し、ハプロタイプ分解されたアセンブリは99%のk-mer多様性を捕捉していることが確認された。
• ゲノム景観: 反復配列要素は約75%のゲノムを構成しており、LTRレトロトランスポゾン（41%）が支配的である。LTR活性の進化解析により、祖先的なWGDイベントに関連している可能性のある、2つの主要な拡大バーストが明らかになった。
• 遺伝子内容: コンセンサス・アノテーションは、35,281個のタンパク質符号化遺伝子と41,252個のトランスクリプトアイソフォームを特定した。平均遺伝子長は4,864 bpであり、1つのトランスクリプトあたり平均5.6個のエキソンを持つ。
• 差分的発現: 27,414個の共有遺伝子のトランスクリプトーム解析の結果、ほとんどの遺伝子は等しく発現しているものの、3%（832個）の遺伝子がハプロタイプ間で有意な差分的発現を示した。特に、56個の遺伝子が「ハプロタイプ限定的」な発現パターン（一方のハプロタイプでは発現しているが、他方ではサイレンシングされている）を示しており、強力なアレル特異的転写制御の存在を示唆している。

意義および主張
本論文は、OleurPic101を、連続性と正確性の面で新たなベンチマークを確立する、これまでに発表された中で最も高品質なオリーブゲノムアセンブリの一つとして提示している。本研究の主要な意義は、高度にヘテロ接合的な種において、計算によるフェージング（phasing）を適用して2つのアレルバージョンを分離することに成功した点にある。コンセンサス配列を超えて、従来のアセンブリがオリーブの全ゲノム多様性を表現できていなかったことを、著者らは実証した。得られたハプロタイプ分解アセンブリは、構造変異、アレル多様性、およびアレル特異的遺伝子発現を研究するための、より正確な基盤を提供する。差分的発現遺伝子、特に一方のハプロタイプに限定的な発現を示す遺伝子の特定は、ヘテロ接合性を維持することの機能的重要性を浮き彫りにしており、ハプロタイプ特異的な制御がこの種の生物学において重要な役割を果たしていることを示唆している。このリソースは、新たな環境変化に適応するためのゲノミクス支援育種戦略を支援することを目的としている。