Integrated Single-Cell and Spatial Transcriptome Analysis Reveals the Biological Characteristics and Regulatory Mechanisms of Atypical Epithelium in Solid-Type Adenoid Cystic Carcinoma

技術要約：固型腺様嚢胞癌における単一細胞および空間トランスクリプトーム解析の統合的研究

問題提起
固型腺様嚢胞癌（ACC）は、唾液腺や外分泌腺に発生する稀で高度に浸潤性の高い悪性腫瘍であり、臨床予後が不良（5年生存率50%未満）であり、進行症例に対する効果的な治療選択肢が欠如している。バルク組織解析では、*MYB-NF*融合やシグナル伝達経路（NOTCH、PI3K/AKT/mTOR）の異常といった主要なドライバーが特定されているが、これらのアプローチでは、攻撃的な表現型を駆動していると考えられる腫瘍内細胞の不均一性が不明瞭となっている。具体的には、固型ACCに特有の悪性転換、脱分化、および免疫逃避の分子メカニズムは依然として解明されていない。本研究は、固型ACCが非固型サブタイプには存在しない、プロ悪性（pro-malignant）な腫瘍細胞サブポピュレーションを保有しているのか、また、これらの集団がいかにして攻撃的な増殖と浸潤を駆動しているのかという理解のギャップに対処するものである。

方法論
本研究では、単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-seq）、空間トランスクリプトミクス（ST）、および広範な機能検証を統合したマルチモーダルなアプローチを採用した。

• データ取得および処理: 8例のACC患者（固型3例、篩状型3例、管状型2例）の外科切除検体を用いてscRNA-seqを実施（10x Genomics Chromiumを使用）。空間トランスクリプトミクス（Visium）は、新鮮な固型および非固型ACC組織に対して実施した。データ処理には、Seurat（SCTransform、バッチ補正のためのHarmony）およびCellRanger/SpaceRangerパイプラインを用いた。
• 計算解析:
  • クラスタリングと注釈付け: 細胞系譜特異的マーカー（管腔細胞：KRT7/8/18、筋上皮細胞：ACTA2/TAGLN）を用いて腫瘍細胞をクラスタリングし、注釈を付与した。
  • 軌跡推論: Monocle2を用いて、細胞状態遷移の擬時間軌跡を再構成した。
  • 制御ネットワーク: SCENICを用いて、転写因子（TF）レギュロン活性を推定した。
  • 細胞間コミュニケーション: CellChatパッケージを用い、免疫逃避経路に焦点を当てたリガンド・受容体相互作用を解析した。
  • 濃縮解析: Gene Ontology（GO）およびパスウェイ濃縮解析をclusterProfilerを用いて行った。
• 実験的検証:
  • 臨床検体: 免疫蛍光染色（IF）およびウェスタンブロッティング（WB）を用い、マーカー（KRT81、MACC1、MESP1、EMTマーカー）のタンパク質発現を固型および非固型組織間で検証した。
  • in vitro モデル: 初代ACC細胞およびSACC-83細胞株を使用した。機能アッセイには、コロニー形成、創傷治癒、およびTranswell浸潤アッセイが含まれる。
  • 遺伝子操作: レンチウイルスベクターを用い、SACC-83細胞においてMESP1の過剰発現およびMACC1のノックダウンを行った。
  • 免疫相互作用: THP-1由来マクロファージを腫瘍細胞の条件培地と共培養し、IFおよびRT-qPCRを用いて、MIFアンタゴニストISO-1の有無による影響を含め、M2極性化（CD206、IL-10、MRC1）を評価した。
  • in vivo モデル: BALB/c-nu nudeマウスを用いた皮下移植モデルを用い、野生型、MESP1過剰発現細胞、およびMESP1過剰発現/MACC1ノックダウン細胞の腫瘍成長ダイナミクスを評価した。

主要な貢献および結果

1. 非古典的上皮サブポピュレーションの同定:
   scRNA-seqにより、固型ACCにおける2つの明確な非古典的上皮サブポピュレーション、すなわち**脱分化上皮（Dee）と増殖上皮（Pe）**が明らかになった。これらのクラスターは、古典的な管腔および筋上皮マーカーの発現が減少している一方で、増殖関連遺伝子（MKI67, CDK1, CCNE1）の上昇を示した。擬時間解析の結果、DeeとPeは同じ終末分化状態へと収束することが示され、共通の起源または軌跡を示唆している。これらのサブポピュレーションは、非固型サブタイプと比較して固型ACCにおいて有意に濃縮されていた。

2. 分子マーカーとしてのKRT81:
   本研究は、**ケラチン81（KRT81）**がこれら非古典的上皮細胞の特異的マーカーであることを特定した。KRT81はDeeおよびPeクラスターで高発現しているが、古典的な上皮細胞ではほとんど発現していない。空間トランスクリプトミクスおよび免疫蛍光染色により、KRT81と増殖マーカーであるMKI67が、固型ACC組織において空間的に共局在していること、および非固型組織と比較して固型組織においてタンパク質レベルが有意に高いことが確認された。

3. MESP1/MACC1軸による悪性化の駆動:
   SCENIC解析により、非古典的上皮細胞において特異的に活性化される主要な転写因子としてMESP1が同定された。モチーフ解析により、MESP1がMACC1（大腸癌関連転移因子1）を直接制御することが予測された。

   • 検証: SACC-83細胞におけるMESP1の過剰発現は、MACC1およびEMTマーカー（N-カドヘリン、ビメンチン）を上昇させ、コロニー形成能、移動能、および浸潤能を増強させた。
   • レスキュー実験: MESP1過剰発現背景におけるMACC1のノックダウンは、これらの悪性表現型を有意に逆転させた。
   • in vivo: MESP1過剰発現細胞から派生した腫瘍は野生型よりも大きかったが、MACC1を同時ノックダウンした腫瘍は小さくなり、MACC1が腫瘍成長を駆動するMESP1の核心的な下流エフェクターであることが確認された。

4. MIFを介したM2極性化による免疫逃避:
   細胞間コミュニケーション解析により、非古典的上皮細胞（PeおよびDee）が**移行阻止因子（MIF）**の主要な供給源であり、これがCD74/CD44およびCD74/CXCR4受容体を介して免疫細胞（特に骨髄系細胞）にシグナルを送ることが明らかになった。

   • メカニズム: 固型ACC組織ではMIFの分泌が高まっていた。in vitroにおいて、MIF刺激はM2マクロファージへの極性化（CD206、IL-10、MRC1の上昇）を誘導したが、この効果はMIFアンタゴニストISO-1によって消失した。
   • 臨床的相関: 固型ACC組織は、非固型と比較してCD206陽性のM2マクロファージの割合が高いことを示しており、上皮細胞からのMIF分泌が免疫抑制的な腫瘍微小環境を促進していることが結び付けられた。

意義および主張
著者らは、本研究が固型ACCの細胞不均一性を体系的に解明し、非古典的上皮細胞を、その攻撃的な表現型を駆動する特徴的なサブポピュレーションとして特定したと主張している。本研究は以下の通り述べている。

• KRT81は、固型ACCを非固型サブタイプから区別するための新規な分子タイピングマーカーとして機能し、凍結切片や生検による迅速な診断を支援する可能性がある。
• MESP1/MACC1軸は、腫瘍細胞の脱分化および過増殖を制御する中核的な調節メカニズムである。
• MIF分泌は、M2マクロファージの極性化を促進することで免疫逃避を容易にする。

結論として、本論文は、これらの知見が現在の治療課題に対処するための新しい分子標的（MESP1、MACC1、MIF）を提供すると述べている。著者らは、これらの経路（例えば、MACC1阻害剤、E2F阻害剤、またはMIFシグナル阻害剤）を標的とすることが、特定されたメカニズムから導き出される潜在的なトランスレーショナルな価値として、新たな治療戦略を提供し得ることを示唆している。