MYD88-silencing hUCMSC-derived extracellular vesicles alleviate sepsis- associated encephalopathy by modulating neurovascular and microglial inflammation

技術要約：MYD88サイレンシングを施したhUCMSC由来細胞外小胞による敗血症関連脳症の緩和

問題提起
敗血症関連脳症（SAE）は、全身感染中に発生する広範な脳機能障害であり、持続的な神経炎症、神経血管損傷、および長期的な認知機能障害を特徴とする。現在の臨床管理は感染制御と臓器サポートに焦点を当てており、慢性的な神経認知損傷を防ぐための確立された脳保護戦略を欠いている。SAE生存者における主要な病理学的特徴は、Toll様受容体（TLR）およびインターロイキン-1受容体（IL-1R）の中核的なシグナル伝達アダプターであるMyeloid differentiation primary response 88（MYD88）の持続的な上昇である。ミクログリアおよび血管内皮細胞におけるこの持続的なMYD88シグナル伝達は、神経炎症、酸化ストレス、および血液脳関門（BBB）の破壊を駆動する。間葉系幹細胞由来細胞外小胞（MSC-EVs）は固有の免疫調節能を示すが、確立された敗血症後における神経血管損傷を治療するために、特定の細胞内標的をサイレンシングするようにエンジニアリングされた能力については、未だ探索されていない。

方法論
本研究では、SAEを誘発するために盲腸結紮穿刺（CLP）マウスモデルを用いた。

• 介入デザイン： 「レスキュー」介入戦略を採用した。エンジニアリングされた細胞外小胞（EVs）による治療は、急性敗血症ショック期ではなく、神経炎症が確立された段階であるCLP後72時間（Day 3）に開始された。
• EVエンジニアリング： ヒューマン臍帯由来間葉系幹細胞（hUCMSC）由来のEVsを単離し、エレクトロポレーション法によりMYD88標的siRNA（siMYD88）をロードした。陰性対照として、siNC-EVs（コントロールsiRNAロードEVs）を用いた。
• in vitro検証： RNaseによる分解に対するEVsの保護能力、およびLPS刺激下のBV2ミクログリア細胞および初代ミクログリアにおけるMYD88ノックダウンの有効性を検証した。
• in vivo評価：
  • デリバリー： DiIラベル化されたEVsを尾静脈投与し、脳への進入とミクログリアへの取り込みを確認した。
  • 治療プロトコル： 生存したCLPマウスに対し、Day 3からDay 8まで、siMYD88-EVsまたはsiNC-EVsを毎日尾静脈注射した。
  • アウトカム指標： BBB透過性（Evans blueアッセイ）、分子シグナル（Western blot/免疫蛍光染色によるMYD88、NF-κB、COX2、NRF2/HO-1、TREM2、MMP9、Claudin-5）、海馬の微細構造（ミトコンドリアおよびシナプスの透過型電子顕微鏡観察）、および行動学的アウトカム（オープンフィールド、バーンズ迷路、新規物体認識）を評価した。

主な貢献および結果

1. 持続的なMYD88の上昇： 本研究は、CLP生存者の海馬および前頭前皮質において、MYD88タンパク質の発現が有意に高いレベルで維持されていることを確立した。これはIBA1陽性のミクログリアおよびCD31陽性の血管内皮構造と共局在していた。
2. エンジニアリングされたEVデリバリーと保護： siMYD88をロードしたEVsは、RNaseによるsiRNAの分解から保護することに成功し、ミクログリアにおける機能的なMYD88ノックダウンを媒介した。全身投与の結果、EVsは脳内に蓄積し、特にミクログリアの細胞体へと集積した。
3. BBB完全性の回復： siMYD88-EV処理は、血管関連のMYD88過剰発現を有意に減少させた。これは、マトリックスメタロプロテアーゼ-9（MMP9）誘導の抑制、Claudin-5発現の回復、およびEvans blue漏出の著明な減少を伴い、BBBの完全性が保持されていることを示した。
4. 炎症・酸化還元シグナルの変調： 海馬において、siMYD88-EVsはTLR4-MYD88-NF-κB-COX2炎症軸を抑制した。極めて重要なことに、この抑制は敗血症によるNRF2/HO-1抗酸化経路の障害を逆転させ、NRF2およびHO-1レベルを回復させると同時にKEAP1を減少させた。
5. ミクログリアのリバランシング： 単なる抑制を超えて、MYD88サイレンシングはミクログリアの表現型をシフトさせた。それは、恒常性および修復関連のミクログリア応答に関連するマーカーであるTREM2の発現を増強し、プロ炎症状態から修復状態へのシフトを示唆した。
6. 微細構造および行動の回復： 処理により、海馬のミトコンドリア構造（膨潤およびクリステの破壊の減少）およびシナプス微細構造（ポストシナプス密度厚さおよび小胞密度の回復）が保持された。行動学的には、siMYD88-EVsは、未治療群またはコントロールEV処理群と比較して、不安様行動、空間学習（バーンズ迷路）、および認識記憶（新規物体認識）を有意に改善した。

意義および主張
本論文は、持続的なMYD88シグナル伝達が、標的化可能なドライバーとして敗血症後の神経血管損傷および神経炎症を引き起こしていると主張している。本研究は、エンジニアリングされたhUCMSC-EVsが、MYD88のような細胞内標的をサイレンシングするための細胞フリーRNAデリバリー戦略として使用できることを支持している。

著者らは、以下の二重の作用機序を提示している：

1. 血管保護： 内皮細胞のMYD88を阻害することで、細胞外マトリックスの分解（MMP9による）を防ぎ、タイトジャンクション（Claudin-5による）を回復させることで、BBBの完全性を再構築する。
2. 神経免疫のリバランシング： ミクログリアにおいて、MYD88ノックダウンは標準的なNF-κB炎症シグナルと酸化ストレスを減少させると同時に、NRF2/HO-1抗酸化防御を再活性化し、TREM2に関連する修復応答を促進する。

本研究は、このアプローチがSAEに対する潜在的な治療経路を提供すると結論付けており、急性感染期だけでなく、長期的な認知および神経血管機能不全の持続的な分子駆動因子を標的とすることで、現在の管理におけるギャップに対処するものである。著者らは、結果は有望であるが、細胞特異的なデリバリーメカニズム、長期的な安全性、および最適な治療窓を定義するためにはさらなる研究が必要であるとし、控えめなトーンを維持している。