Seasonality shapes host associations and functional potential of virome in a brackish water lagoon

技術要約：季節性が汽水ラグーンにおける宿主との関連性およびウイルス・ゲノムの機能的可能性を形成する

問題提起
汽水ラグップは生物地球化学的に最も活動的な生態系の一つであるが、バルト海のような温帯システムと比較して、特に熱帯地域におけるウイルスコミュニティの研究は著しく不足している。ウイルスは「ウイルス・シャント」や補助代謝遺伝子（AMGs）のコードを通じて微生物コミュニティの構造や栄養塩循環を駆動することが知られているが、熱帯の汽水環境におけるウイルス－宿主相互作用、ウイルス多様性、および機能的可能性の具体的なダイナミクスについては、依然として解明が進んでいない。本研究は、強い季節的な水文学的変化（具体的にはモンスーン）が、アジア最大の汽水ラグーンであるチリカ湖において、いかにウイルスコミュニティを構造化し、その代謝的役割を調節しているかという空白を埋めるものである。

方法論
本研究では、2020年の夏季（3月）、モンスーン期（7月）、冬季（11月）の3つの異なる季節にわたり、チリカ湖の13のサンプリング地点を用いた包括的なメタゲノム・アプローチを採用した。

• サンプリングとシーケンシング： 0.45 μmのメンブレンフィルターでろ過した水サンプルから環境DNA（eDNA）を抽出した。ライブラリはIllumina TruSeq DNA PCR-freeプロトコルを用いて調製され、NovaSeq 6000プラットフォームでシーケンシングされた。
• ウイルス同定パイライン： 共アセンブルされたメタゲノムからウイルスコンティグを同定するために、新規のマルチツール複合スコアリング行列を開発した。このフレームワークは、VIBRANT、VirSorter2、DeepVirFinder、およびCheckVの4つのツールによる予測を統合したものである。コンティグは、特定の基準（例：ホールマーク遺伝子の存在、完全性、および品質指標）に基づき「TotalScore」を割り当てられた。TotalScoreが1以上かつ長さが3 kb以上のコンティグのみが高信頼性のウイルス配列として保持された。
• ダウンストリーム解析：
  • 分類学： geNomad、Cenote-Taker 3、およびPhaBox2を用いた厳格な多数決コンセンサス法を適用し、分類学的割り当てを行った。
  • ライフスタイルと宿主予測： ウイルスのライフスタイル（溶菌性 vs 溶原性）は、BacPHLIPおよびPhaTYPを用いて予測された。宿主との関連性は、iPHoP（2,000以上のチリカ湖プロカリオートゲノムを含むカスタムデータベースを組み込み）およびPhaBox2（真核生物宿主用のCHERRYモジュール）を用いて推論された。
  • 機能解析： 補助代謝遺伝子（AMGs）は、DRAM-vおよびVIBRANTを用いて同定および精査された。その際、宿主に組み込まれた遺伝子や可動性遺伝要素を除外するための厳格なフィルタリングを行った。AMGの存在量は、深度重み付けスコアリング法を用いて定量化され、季節的な濃縮を評価するためにZスコアによって正規化された。
  • 統計モデリング： ウイルスコミュニティ組成と物理化学的変数との関連付けに冗長性分析（RDA）を用いた。季節的な構造的差異を評価するために、PERMANOVAおよびNMDS/PCoAを用いた。

主な結果

• ウイルス多様性と品質： 本研究では440,080の高信頼性ウイルスコンティグが生成された。データセットは低品質のコンティグ（n=364,312）によって支配されていたが、これは断片化された環境ウイルスゲノムのアセンブリにおける課題を反映しており、世界の海洋ウイルス叢で見られるパターンと一致している。しかし、1,265の完全なゲノムと1,271の高品質ゲノムが回収された。
• 分類学的組成： Caudoviricetes（尾部を持つバクテリオファージ）が圧倒的に支配的なクラスであり、全季節を通じて溶菌性コミュニティの約94%、溶原性コミュニティの約92%を占めた。マイナーなクラスとしてMegaviricetesとMaveriviricetesが含まれ、これらは季節変動を示した。
• ライフスタイル・ダイナミクス： コミュニティは主に溶菌性であった（品質ティア間で82〜99%）。溶原性の割合は完全/高品質ゲノムにおいて高かった（~17–18%）が、低品質ティアでは大幅に低下した。これは、検出に必要なインテグラーゼやリプレッサー遺伝子の断片化によるものと考えられる。
• 宿主との関連性：
  • プロカリオート： 割り当てられた宿主の大部分は細菌であった。FlavobacteriaceaeおよびSynechococcaceaeが最も顕著な宿主科であった。Pseudomonadota（Proteobacteria）が主要な宿主門（35.9%）であり、次いでCyanobacteriota（24.9%）、Bacteroidota（23.4%）であった。
  • 真核生物： 真核生物の宿主はChlorophyta（55.8%）、特にMamiellophyceae、およびHaptophyta（17.2%）によって支配されていた。真核生物に感染するウイルスコミュニティは、プロカリオートへの感染と比較して、Megaviricetesの割合が高かった（43.7%）。
• 季節的要因： 冗長性分析により、塩分濃度、水温、および透明度がウイルスコミュニティ構造の主要な駆動因子であり、分散の62%を説明することが特定された。淡水の流入を特徴とするモンスーン期は、最も明確なコミュニティの変化をもたらした。
• 機能的可能性（AMGs）： 3つの明確な季節的代謝パターンが明らかになった：
  • モンスーン期： ポルフィリンおよびクロロフィル代謝（濁度の高い条件下で光合成を維持するシアノファージに関連）、窒素代謝、および二次代謝産物の生合成（様々な抗生物質経路を含む）が優勢であった。
  • 冬季： 硫黄代謝、プロカリオートにおける炭素固定、およびエネルギー代謝によって特徴付けられ、化学自栄養プロセスへのシフトを示唆している。
  • 夏季： 炭水化物およびアミノ酸代謝が優勢であった。
• ウイルス－宿主－AMGの連関： 特定のAMGsを保有するウイルス科と宿主門との間に、統計的に有意な関連性が確立された。例えば、Phycodnaviridaeは夏季のChlorophyta（炭水化物代謝）と有意に関連しており、一方でPeduoviridaeは冬季のPseudomonadota（炭水化物代謝）に関連していた。

意義と主張
本論文は、熱帯の汽水ラグーンにおけるウイルスコミュニティに関する初の包括的なメタゲノム調査を提供すると主張している。その主な貢献は以下の通りである：

1. 方法論的厳密性： 複雑なメタゲノムデータセットにおけるウイルス同定の信頼性を向上させる、マルチツール複合スコアリング行列の開発と検証。
2. 生態学的洞察： モンスーンによる水文学的変化が、熱帯汽水システムにおけるウイルス－宿主の代謝相互作用およびAMG組成の主要な季節的駆動因子であることを示したこと。
3. 機能的多様性： ウイルスが多様な代謝経路（例：抗生物質生合成、硫黄循環、光合成維持）をコードしており、それらが季節的な環境ストレスに対して宿主の生理機能や生物地球化学的循環を調節している可能性があることを明らかにしたこと。
4. 基礎的枠組みの構築： 生物多様性に富む熱帯汽水域におけるウイルス－宿主の生態学的枠組みを理解するためのベースラインを確立し、ウイルスコミュニティは静的なものではなく、生態系機能に影響を与える深刻な季節的再構成を受けることを強調したこと。

著者らは、データベースの制限により未割り当てのウイルス多様性がかなりの部分を占めているものの、本研究は季節的な環境変化を特定のウイルス機能戦略へと結びつけることに成功しており、熱帯ラグーンの生物地球化学的循環におけるウイルスの重要な役割を浮き彫りにしていると結論付けている。