Characterization of Parrot Bornavirus-4 Infection in Immortalized and Primary Cell Lines

技術要約：不死化細胞株および初代細胞におけるオウムボルナウイルス4型（PaBV-4）感染の特性解析

問題提起
オウムボルナウイルス4型（PaBV-4）は、オウム目鳥類における前胃拡張症（PDD）の既知の病原体である。PaBV-4は様々な鳥類に感染し、慢性的な非溶菌性感染を確立することが知られているが、宿主範囲に関する細胞レベルの決定因子、in vitroでの増殖過程における遺伝的適応、および関連するオルソボルナウイルスとの相互作用については、依然として十分に解明されていない。特に、異なる許容細胞株間におけるウイルス増殖効率の差が、細胞固有の障壁を反映しているのか、あるいはウイルスの急速な遺伝的適応を反映しているのかは不明である。さらに、持続感染の文脈において、PaBV-4と他のオルソボルナウイルス（具体的には水鳥ボルナウイルス1型、ABBV-1）、または遠縁のモノネガウイルス（ニューカッスル病ウイルス、NDV）との間のウイルス干渉の程度についても、十分に記録されていない。

方法論
本研究では、10種類の細胞株（QT-35、CCL-141、DF-1を含む6種類の不死化細胞株、および哺乳類由来のVero、CT-2_A、BHK-21）を用いた包括的なin vitroアプローチを採用した。

1. 複製キネティクス： PaBV-4を、感染多重度（MOI）0.001でこれらの細胞株に伝播させた。ウイルス拡散を、Nタンパク質発現に対する免疫蛍光染色法（IFA）およびウイルスRNA蓄積に対するRT-qPCRを用いて、6継代（18日間）にわたってモニタリングした。累積的な複製量を定量化するために、経験的曲線下面積（eAUC）を算出した。
2. ゲノムシーケンシング： 遺伝的適応を評価するため、全ゲノムの配列決定を複数の段階（元の組織分離物、アヒル胚線維芽細胞（DEF）における初期分離時、CCL-141におけるストック生産時、およびDF-1、QT-35、CCL-141における増殖曲線完了後［約21〜24継代］）で行った。バイオインフォマティクス・ワークフローを用いて、塩基置換を特定し、見かけの置換蓄積率を算出した。
3. ウイルス干渉研究：
   • オルソボルナウイルス間の干渉： QT-35細胞に、PaBV-4またはABBV-1のいずれかによる持続感染をさせた後、互いのウイルスでチャレンジ（再感染試行）を行った。また、同時混合感染実験も実施した。ウイルスRNAレベルは、RT-qPCRおよびRNAscope in situ ハイブリダイゼーションを用いて45日間（約11継代）追跡した。
   • モノネガウイルス間の干渉： Paв4に持続感染させた細胞に対し、赤色蛍光タンパク質（NDV-RFP）を発現する病原性の弱いニューカッスル病ウイルス（NDV）を、MOI 0.01および1でチャレンジした。感染ウイルス価およびウイルスRNAレベルを、各時点での感染後経過時間とともに測定した。

主な結果

• 細胞の許容性： PaBV-4はほとんどの鳥類細胞株で持続感染を確立したが、哺乳類細胞株（Vero、CT-2A、BHK-21）では複製できず、これまでの宿主制限の知見を裏付ける結果となった。鳥類細胞株の中では、不死化キクイ科線維肉腫（QT-35）細胞およびアヒル胚（CCL-141）細胞が、Nタンパク質発現およびRNA蓄積の両方において最も高いeAUC値を示し、最も高い規模の増殖を支持した。一方で、七面鳥胚線維芽細胞（TEF）は顕著に非許容的であり、ABBV-1の複製を支持するにもかかわらず、免疫反応性およびRNAの有意な増加を示さなかった。
• ゲノムの安定性： 全ゲノムシーケンシングの結果、約24継代後の遺伝的多様化は限定的であった。すべての系統において、24のユニークなゲノム部位で計51箇所の塩基置換のみが特定された。置換は特定の宿主種や細胞株と一貫して関連しておらず、宿主特異的な分子適応が起こっていないことを示している。見かけの置換蓄積率は、平均 6.5 × 10⁻⁵ 置換/サイト/継代と算出された。ポリメラーゼ（L）タンパク質における再発性の変異（L7207、ロイシンからフェニルアラニンへの置換）がすべての許容細胞株で観察されたことは、細胞培養における潜在的な選択的優位性を示唆しているが、特定の細胞型への急速な適応の証拠は見られなかった。
• ウイルス干渉：
  • オルソボルナウイルス： PaBV-4による持続感染は、ABBV-1による二次感染の確立を完全に阻害し、その逆も同様であった。同時混合感染のシナリオでは、PaBV-4がABBV-1を駆逐し、有意に高い累積RNAレベルを達成したことから、競争的な複製優位性を持つことが示唆された。
  • モノネガウイルス： 対照的に、持続的なPaBV-4感染は、NDV-RFPの複製に対して一時的かつ軽微な抑制効果しか及ぼさなかった。一部の細胞株では初期段階でNDVタイターがわずかに低下したものの、これらの差は持続せず、累積的な複製キネティクスにおいて有意な減少は見られなかった。

意義および主張
著者らは、細胞の許容性が、急速なウイルスの遺伝的適応よりも、in vitroにおけるPaBV-4複製の主要な決定因子であると結論付けている。本研究は、PaBV-4が多様な鳥類細胞株での連続継代においてもゲノムの安定性を維持していること、および研究期間内に宿主特異的な適応が起こっていないことを実証している。

さらに、本研究は、近縁のオルソボルナウイルス間（PaBV-4とABBV-1）における強力な双方向のウイルス干渉を明らかにし、これがスーパーインフェクション（二次感染）を効果的に防止することを強調している。この干渉はオルソボルナウイルス科に特有のものであり、遠縁のNDVに対する効果は一時的かつ弱い。これらの知見は、PaBV-4の宿主範囲の制限は、表面受容体の利用可能性ではなく、ポストエントリーの宿主因子（核局在化シグナルの認識など）によって制御されている可能性が高いことを示唆している。また、PaBV-4が七面鳥細胞で複製できないことは、他の鳥類オルソボルナウイルスと比較した際の真の宿主範囲の違いを反映している可能性がある。本研究は、QT-35およびCCL-141がPaBV-4のストック生成のための効率的な製造細胞として適していることを支持している。