Class-Support Mismatch Dominates Protocol-Driven Optimism in Spatial Transcriptomics, with a Larger Residual Penalty for Graph Neural Networks

技術要約：空間トランスクリプトミクスにおけるクラス・サポートの不一致がプロトコル主導の楽観主義を支配する

1. 問題提起

空間トランスクリプトミクス（ST）のベンチマークは、空間ブロック交差検証（CV）と比較して、ランダムにインターリーブされた交差検証を使用した場合に、性能指標が膨張して報告される傾向がある。この「ランダム対ブロック」の性能差に対する一般的な帰属は、**空間的リーク（spatial leakage）**である。すなわち、グラフニューラルネットワーク（GNN）におけるメッセージパッシングや空間的自己相関によって、テスト情報の訓練データへの汚染が起こるという主張である。

しかし、この帰属は厳密に検証されたことがない。なぜなら、ランダムからブロックCVへの切り替えは、同時に5つの異なる設計軸を変更してしまうからである：

1. 訓練セットのサイズ： ブロック・プロトコルはバッファゾーンを破棄するため、訓練スポットの数が大幅に減少する。
2. クラス・サポート（Class support）： 連続したブロックは、組織セクション全体に存在する多様な組織ドメインを欠くことが多く、訓練時とテスト時のクラス集合の不一致を引き起こす。
3. クロスロール・メッセージパッシング： ランダムな分割は多くの訓練・テスト間の隣接ペアを生むが、ブロック分割は境界でグラフを切断する。
4. 前処理の範囲： グローバルな前処理（例：遺伝子選択、スケーリング）対、フォールド局所的な前処理。
5. 空間的外挿： 未知の空間領域を予測するという、実際の科学的課題。

単一の性能差統計量はこれらの要因を混同しており、「リーク」をクラス・サポートの不一致のような他のアーティファクトから分離することを不可能にしている。

2. 方法論

著者は、10x Visiumヒト乳がんデータ（3,798スポット、11 Leidenドメイン）を用いた詳細な監査研究を行い、12の専門家注釈付きDLPFCセクション（47,280スポット）でその知見を再現した。

グラフの枝刈りと検証：
メッセージパッシングによるリークを排除するため、著者は「ゼロ汚染」グラフを構築した。各フォールドにおいて、以下の条件を満たすように空間グラフを枝刈りした：

• ゼロ・クロスロール・エッジ： 訓練、検証、またはテストノード間を接続するエッジが存在しないこと。
• 無限ホップ距離： 訓練ノードとテストノードの最小ホップ距離が無限であること。
• 検証： 2つの独立した実装がこれらの特性を検証し、バッファゾーンだけでは不十分であることを確認した（バッファゾーンはブロックは除去するが、それらを接続するエッジは除去しないため）。

プロトコル・ラダー（Protocol Ladder）：
本研究では、11本の腕を持つ加法的な分解を用いる「プロトコル・ラダー」を採用した。設計軸を一つずつ変更することで（例：クラス・サポート、サイズ、グラフ・マスキング、または前処理の範囲を一致させる）、総性能差に対する各因子の寄与を分離した。

• ベース・ラダー： 総ギャップ（ランダム対ブロック）を、訓練セットのサイズ、クラス・サポート、空間（残差）、および前処理の範囲へと加法的に分解した。
• マスクされた腕（Masked Arms）： ランダムとブロックのプロトコル間でグラフ・マスキング規則と前処理の範囲を一致させることで、GNNに対する空間的ペナルティのデコンファウンディング（混同除去）を行った。

パーシステント・ホモロジー監査：
著者はパーシステント・ホモロジー（トポロジー）特徴量の有用性を再評価した。以前の「共有グラフ」による特徴量計算（これは訓練情報をテスト情報へとリークさせていた）を、各フォールドの役割に応じた誘導サブグラフ内でのみ厳密に計算される帰納的なルールに置き換えた。

統計フレームワーク：

• 単位： 分析は $n=4$ の独立した空間ブロック（フォールド1と3は同一の分割）に基づいている。
• 区間： 階層的ブートストラップ95%信頼区間。
• 検定： 正確な両側符号置換検定（$n=4$ による下限 $p=0.125$ を適用）。

3. 主な結果

A. ランダム対ブロックのギャップの分解
総閉じたセット（closed-set）のmacro-F1ギャップ +0.447 は、以下のように加法的に分解される：

• クラス・サポートの不一致： +0.276（最大の構成要素であり、ギャップの約62%）。これは、連続したブロックにはすべての組織ドメインが含まれていないため、モデルが訓練時に存在しないクラスを予測せざるを得なくなることに起因する。
• 残差的な空間的外挿： +0.098（約22%）。
• 前処理の範囲： +0.051（約11%）。
• 訓練セットのサイズ： +0.022（約5%）。

B. GNNのペナルティ
サイズ、クラス・サポート、グラフ・マスキング、および前処理の範囲を一致させた後：

• グラフニューラルネットワーク (GCN, GAT)： 実質的な残差空間ペナルティ +0.214 (CI: +0.160, +0.273) を示す。
• 非グラフ分類器 (SVM, XGBoost, kNN, MLP)： 小さな未解決のペナルティ +0.042 (CI: -0.039, +0.143) を示し、これにはゼロが含まれる。
• ファミリー・ギャップ： GNNと非グラフ手法のペナルティの差は +0.172 であり、GNNに対してのみ統計的に判別可能である。

C. メッセージパッシングとリーク

• ブロック・プロトコル下でのクロスロール・メッセージパッシングは、ギャップに対して +0.050 (GCN) および +0.016 (GAT) の寄与をする。
• 非グラフ手法の場合、この値は正確に 0.000 である。
• 著者は、メッセージパッシングによるリークは実在するが軽微なチャネルであり、観察された楽観主義の主要な要因ではないと結論付けている。

D. パーシステント・ホモロジー
以前報告されたトポロジー的利点 +0.0154 macro-F1は、完全にリークによるアーティファクトであった。

• 特徴量を各フォールド内で帰納的に再計算すると、その利点は消失する。
• クリーンな推定値は -0.0144 (SD 0.0269, $p=0.50$) であり、これはTopoSpatialと、トポロジーを持たない一致させたGATとの間に差がないことを示している。

E. 手法のランキング逆転 (DLPFC)
12のDLPFCセクションにおいて、手法のランキングはプロトコルによって逆転した：

• ランダムCV： XGBoost-PCA+XY（生の座標を使用）が、SVM-PCAを大幅に上回った。
• ブロック/Leave-One-Out CV： SVM-PCAがXGBoost-PCA+XYを上回った。
• これは、ランダムCVのみに依存するベンチマークが、生物学的な特徴を学習するのではなく、空間的自己相関（座標経由）を搾取する劣った手法を一貫して選択してしまう可能性があることを示している。

4. 意義と主張

本論文は、STベンチマークにおける「空間的リーク」に関する分野の理解を修正することを目的としている。主な貢献は以下の通りである：

1. 「リーク」というモノリス（単一概念）の論破： ランダム対ブロックのギャップは、メッセージパッシング・リークによって駆動される単一の量ではない。支配的な構成要素はクラス・サポートの不一致であり、これは空間的ブロッキングがいかに訓練/テストセットのクラス多様性を減少させるかというアーティファクトである。
2. GNN特有のペナルティ： 真の空間的外挿ペナルティ（未知の空間領域を予測することの困難さ）は、非グラフ分類器よりもGNNにおいて大幅に大きい。これは、GNNが単なるラベル・リークだけでなく、未知の領域における局所的なグラフ・コンテキストの分布に対して特異的に敏感であることを示唆している。
3. 方法論的修正：
   • バッファゾーンは不十分である： それらはブロックを除去するが、エッジは除去しない。メッセージパッシング・リークを排除するには、明示的なグラフの枝刈りと検証が必要である。
   • 特徴量リーク： フルグラフ上で計算されたパーシステント・ホモロジー特徴量は、リークのチャネルとなる。これらはフォールドごとに帰納的に再計算されなければならない。
   • 報告基準： ベンチマークは、単一のインフレート数値ではなく、ギャップの分解（サイズ、クラス・サポート、前処理、空間）を報告しなければならない。空間的外挿への性能低下を帰属させる前に、クラス・サポートを一致させる必要がある。
4. トポロジーに関する負の結果： 本研究は、STにおけるパーシステント・ホモロジーの報告された利点が、モデルの能力ではなく、完全にデータ・リークによるものであったことを示す、明確な負の結果を提供している。

著者は、ターゲットラベルが推移的な（transductive）Leidenクラスターであるため、無条件にリークのないベンチマークを作成したと主張しているのではないが、彼らのプロトコルはメッセージパッシング、ノード特徴量、および前処理に関するリークについてはリークフリーであると断言している。彼らは、「空間的ペナルティ」はGNNにとって実在する現象であり、プロトコルの設計によるアーティファクトとは別物であることを強調している。