The SPFH protein flotillins form endolysosome-ERES contacts that promote unconventional secretion

技術要約：SPFHタンパク質であるフロチリンが、非典型的な分泌を促進するエンドリソソーム-ERES接触を形成する

問題提起
フロチリン（Flot1およびFlot2）は、細胞膜マイクロドメインの組織化やシグナル伝達を促進する役割を持つSPFHファミリータンパク質である。病理学的状態（特に癌）におけるフロチリンの上昇は、不良な予後や小胞輸送の変化（「上昇したフロチリン誘発性トラフィッキング」またはUFIT経路）と関連しているが、そのエンドリソソーム（EL）コンパートメント内における具体的な機能は未定義のままである。フロチリンは過剰発現状態でEL上に蓄積するが、これらがオルガネラの運命、特にリソソームによる分解と細胞外への分泌の間の決定にどのように影響するかは不明である。さらに、ELと分泌経路（特に小胞体およびオートファジー機構）を結びつけるメカニズムについても、さらなる解明が必要である。

方法論
本研究では、プロテオミクス、高度な顕微鏡技術、および機能解析を組み合わせた多角的なアプローチを、複数の細胞株（非形質転換細胞MCF10A、浸潤性BT549、およびHeLa）を用いて用いた。

• インターラクトミクス： ラベルフリー質量分析を用い、コントロールのMCF10A細胞とフロチリン過剰発現MCF10A細胞におけるフロチリン1免疫沈降を行い、発現依存的なタンパク質パートナーを同定した。
• 顕微鏡観察：
  • 共焦点スピニングディスク顕微鏡および3Dセグメンテーション： フロチリン、COPIIタンパク質（SEC31a、SEC13、SEC24a）、LAMP1、およびLC3Bの共局在を可視化するために使用した。
  • 相関光顕微鏡法（CLEM）： 蛍光顕微鏡法と走査電子顕微鏡（SEM）および透過電子顕微鏡（TEM）を組み合わせ、フロチリン陽性ELと小胞体出口部位（ERES）の間の接触部位を超構造的に特徴付けた。
  • ライブセルイメージング： 蛍光レポーター（ddFPベースのER-EL接触センサー、mCherry-GFP-LC3、Haloタグ付きSEC31）を利用して、動的な相互作用と膜の再構築をリアルタイムで追跡した。
• 機能解析：
  • CRISPR/Cas9およびsiRNA： フロチリンノックアウト（KO）細胞の作製、および特定のトラフィッキング遺伝子（SEC31、ATG5、ATG7、LC3B、ALIX、syntenin、CD63）のサイレンシングを行った。
  • RUSHシステム： 「Retention Using Selective Hook」を用い、カーゴ（TNFα、CD63）の小胞体からの放出を同期させ、追跡した。
  • EV定量： ナノルシフェラーゼCD63発光アッセイ、ZetaView粒子計数、およびサイズ排除クロマトグラフィーにより、細胞外小胞（EV）の分泌を測定した。
  • TEM解析： 特定のエンドリソソーム亜型（オートファゴソーム、アンフィソーム、マルチベシキュラーエンドソーム）および腔内小胞（ILV）の存在量を定量化した。

主要な貢献と結果

1. ERESをフロチリンのパートナーとして同定： プロテオミクス解析により、フロチリンの過剰発現がフロチリン複合体におけるCOPIIタンパク質（SEC13、SEC31a、SEC24a）を特異的に濃縮することが明らかになった。この相互作用は、フロチリン発現の低い細胞では観察されなかった。
2. EL-ERES接触部位の形成： CLEMおよびライブイメージングにより、フロチリン陽性ELが、ER-ERGIC界面においてCOPII被覆されたERESと安定した膜接触部位（約70–85秒）を形成することが示された。フロチリンの過剰発現はこれらの接触頻度を増加させ、逆にフロチリンのノックアウトはこれらを減少させた。
3. LC3B/ATG8の動員と非分解的オートファジー： ELへのフロチリンの蓄積は、これらのEL-ERES接触部位へのLC3B（ATG8ylation）の動員を促進する。極めて重要なことに、このLC3の動員は、分解的なオートリソソームではなく、非分解的な分泌型EL（タンデムレポーターにおいてGFPとmCherryの両方を保持）の形成に関連している。フロチリンの過剰発現は、分解フラックス（p62レベルは安定）を増加させることなく、LC3のリピデーションおよびオートファゴソーム/アンフィソームの数を増加させる。
4. 非典型的な分泌のメカニズム： 本研究は、フロチリン-ERES接触によって駆動されるEVバイオジェネシスの2つの非排他的なメカニズムを提案している：
   • 取り込み（Engulfment）： ERES小胞がフロチリン陽性ELによって取り込まれる。
   • 膜の再構築（Membrane Remodeling）： フロチリン陽性ELがERES小胞を集め、それらが膜（おそらくファゴフォアの動員による）に包まれることで、ER由来の腔内小胞（ILV）を含む複雑なELを形成する。
   • 証拠として、SEC31の点状構造がフロチリン陽性EL内に進入する観察結果や、EL内のERES様構造を示すTEM画像が挙げられる。
5. カーゴのローディングとEV分泌： フロチリンの過剰発現は、EVの分泌増加をもたらす。このプロセスは、オートファジー機構（ATG5、ATG7、LC3B）およびESCRT非依存的軸（CD63、syntenin、ALIX）を必要とするが、標準的なESCRT成分（HRS、TSG101）には依存しない。注目すべきは、SEC31のサイレンシングが、フロチリン過剰発現細胞におけるEV分泌を特異的に消失させたことであり、これによりERESへの依存性が確認された。
6. カーゴの特異性： このシステムは、CD63のような特定のカーゴを、ゴルジ体へ到達する前に小胞体から分泌型ELへと直接ローディングすることを促進する。フロチリンの上昇はCD63を安定化させ、分泌されるEVへのその濃縮を強化する。

意義と主張
著者らは、非典型的な分泌を制御する上でのフロチリンの新しい役割を特定したと主張している。彼らは、様々な癌の徴候であるフロチリンの上昇が、獲得機能効果（gain-of-function effect）を駆動すると考えている。すなわち、エンドリソソーム上のフロチリンが、COPIIに富むERESとの接触形成を促進するというものである。この相互作用は、分解的なプロセスを回避する、ATG8ylation依存的な膜再構築プロセスを開始させる。その代わりに、これは「分泌型オートファゴソーム」または複雑なELの形成を促進し、カーゴ（EVを含む）を非典型的な分泌によって放出する。

本論文は、フロチリンを介したEL-ERES接触が、細胞の恒常性を分解から分泌へとシフトさせる重要な調節ノードであることを結論付けている。このメカニズムは、フロチリンが上昇した腫瘍細胞が、どのようにしてEV分泌を増強することで、細胞間コミュニケーションや微小環境の再構築を促進し得るかを説明している。これらの知見は、COPII小胞およびオートファジー機構の役割を再定義するものであり、これらが病理学的状態において、ER由来の物質を分泌小胞へと直接転送するために転用されていることを示唆している。