Spatial O-GalNAc glycoproteomics atlas: region-specific regulation across the mouse brain

技術要約：マウス脳における空間的O-GalNAc糖タンパク質プロテオミクス・アトラス

問題提起
ムチン型O-GalNAc糖鎖修飾は、神経細胞のコミュニケーション、接着、およびシグナル伝達を制御する重要な翻訳後修飾である。このプロセスを開始する20種類のGalNAc転移酵素（GALNTs）は部位特異的な制御を提供するが、哺乳類の脳全体におけるO-GalNAc糖鎖修飾の、領域解明された系統的な定量的アトラスはこれまで欠如していた。Allen Brain Atlasなどの既存のリソースはトランスクリプトミクスに焦点を当てており、タンパク質の糖鎖修飾を捉えることはできない。さらに、分析上の課題により、希少で解剖学的に定義された脳領域への糖プロテオミクスの適用が困難であった。具体的には、O-GalNAc糖鎖の不均一性と、Ser/Thrに富む領域における糖鎖のクラスター化が、標準的な高エネルギー衝突解離（HCD）フラグメンテーション下でのサイト局在化を困難にしている。HCDでは糖鎖部位が優先的に切断されるため、データ依存的解析（DDA）スペクトラルライブラリにおいて「位置的冗長性」が生じる。これは、単一の前駆体シグナルが、糖鎖部位の局在のみが異なる互いに排他的な糖ペプチドアイソマーに一致してしまう現象である。この冗長性は、探索空間を膨張させ、統計的スコアリングを複雑にし、多数のサンプル間で一貫した定量化が可能であるとされるデータ非依存的解析（DIA）ワークフローのスケイラビリティと再現性を制限している。

手法：Glyco-DIA 2.0
これらの限界に対処するため、著者らは、定量的O-GalNAc糖プロテオミクスのための非冗長かつDIA中心のワークフローであるGlyco-DIA 2.0を開発した。

• 非冗長スペクトラルライブラリ設計: 革新的な点は、糖鎖組成を特定の糖鎖部位の局在から切り離すライブラリ構築戦略である。HCD下でのアイソマー的冗長性を回避するため、糖鎖を個々のセリンまたはスレオニン残基に割り当てるのではなく、累積的な糖鎖質量をペプチド主鎖に対する仮想的なN末端修飾として扱う。これは、「糖鎖減算」検索戦略（subHCD）によって実現される。この戦略では、データベース検索の前に前駆体質量から累積的な糖鎖質量を差し引く。これにより、O-糖ペプチドのMS/MSスペクトルを実質的に非糖鎖化されたペプチドスペクトルとして解釈することが可能となり、スペクトルの冗長性を大幅に減少させ、同定率を向上させる。
• 試料調製: 生後21日目（P21）のC57BL/6jマウス脳を、10の解剖学的領域（嗅球、大脳皮質、海馬、視床、視床下部、中脳、橋、延髄、小脳、脈絡叢）に微細解剖した。サンプルは脱シアル化（末端の不均一性を減少させ、レクチン結合を強化するため）を行い、トリプシン消化の後、ジャカリン（Jacalin）を用いた弱親和性クロマトグラフィーによってT型およびTn型エピトープを濃縮した。
• 質量分析:
  • ライブラリ生成: 全脳および混合コンパートメントサンプルを用いて、長時間のグラジエントを用いたナノLC-MS/MS（DDAモード）により、深い参照ライブラリを生成した。全脳サンプルについては、高pH逆相クロマトグラフィーによる分画も行った。
  • 定量化: 9つの脳コンパートメント（入力の違いにより全脳と脈絡叢は差次的解析から除外）に対して、DIA質量分析を用いて空間マッピングを行った。
    型 検証: 構造注釈のための曖昧さのない糖鎖部位マップを生成するために、別途ETDベースのワークフローを用いた。
• データ解析: ワークフローは、Proteome DiscovererのDDA出力をSpectronaut互換の非冗長ライブラリに変換する自動Rベースのパイプラインを利用している。定量的データは、ロバストな統計解析を確実にするため、分散安定化正規化（vsn）、バッチ補正（ComBat）、および欠損値補完（ランダムフォレストベース）を経ている。

主な結果

• 深い参照ライブラリ: 本研究は、13,007個のO-GalNAc糖ペプチド前駆体および9,769個の一意な糖ペプチド配列、ならびに817個の糖タンパク質からなる包括的な参照ライブラリを生成した。これは、最近のデータセットと比較して、マウス脳の既知のO-GalNAc糖プロテオームを520個の糖タンパク質分拡張したものである。
• 空間アトラス: Glyco-DIA 2.0を9つの脳領域に適用した結果、534個の異なる糖タンパク質に由来する4,008個の一意な糖ペプチドからなる高信頼性データセットが得られた。
• 糖鎖組成: データセットは、Mono-glycosylated Hex(1)HexNAc(1)（Tエピトープ、47.2%）およびHexNAc（Tn抗原、8.7%）によって支配されていた。高次の組成は、単一の複雑な糖鎖ではなく、複数の部位における短いコア-1構造の累積的な占有率を表していることが判明した。
• 領域特異的な制御: 主成分分析（PCA）により、明確な領域依存的な組織化が明らかになった。視床下部と嗅球は明確にクラスタリングし、橋、延髄、小脳は関連したクラスタリングを示した。
• 調節のデカップリング: 定量プロテオミクスとの統合により、糖鎖パターンがタンパク質存在量のみによって駆動されるのではないことが明らかになった。研究では、以下の3つの調節状態を特定した：
  • 一致した制御 (CR): 糖ペプチドの存在量とタンパク質の存在量が共に変化する。
  • 糖ペプチド特異的制御 (GSR): タンパク質レベルとは独立して、糖鎖占有率の変化が起こる。
  • 不一致な制御 (DR): 糖ペプチドの存在量とタンパク質の存在量が逆方向に変化する。
    VGF、IGFBP5、CX3CL1、CD44、GFRA2、およびAPLP1を含む多くのタンパク質がGSRまたはDRを示しており、糖鎖占有率のレベルでの複雑な制御を示唆している。
• タンパク質内のリモデリング: データは、個々のタンパク質内での空間的リモデリングを明らかにした。例えば、CX3CL1は、中脳/嗅球における膜近傍領域に対し、橋/延髄においてはN末端スタックにおいて優先的に糖鎖修飾を受けており、領域特異的な糖プロテオフォームの生成を示唆している。

意義および主張
著者らは、本研究がマウス脳における最初の空間的に解明されたO-GalNAc糖鎖占有率アトラスを確立したと主張している。DIAワークフローにおける位置的冗長性の分析的ボトルネックを克服することで、Glyco-DIA 2.0は、限られたサンプル入力であっても、定量的な組織特異的糖プロテオミクスを実現するためのスケーラブルな枠組みを提供する。

本研究は、O-GalNAc糖鎖修飾が、タンパク質発現レベルとは別個の、かつしばしば独立した、哺乳類の脳における追加の空間的分子制御レイヤーを構成していることを示している。この制御は、タンパク質の折り畳み、トラフィッキング、プロテアーゼ感受性、および受容体クラスター化に影響を与える。著者らは、これらの領域特異的な糖プロテオフォームが、シナプス組織化、軸索ガイダンス、および髄鞘生物学に異なる影響を与える可能性があると仮定している。

コミュニティによるアクセスとさらなる調査を促進するため、著者らはインタラクティブなウェブリソースである**GlycoDB (glycodb.org)**を公開した。このプラットフォームにより、ユーザーは空間的な糖鎖パターンを探索し、領域ごとの存在量を比較し、疑似ヒートマップを介してタンパク質内のリモデリングを可視化し、構造データ（AlphaFoldモデル）と糖鎖部位を統合することができる。著者らは、このリソースが中枢神経系におけるO-GalNAc糖鎖の役割を調査するための基礎を提供するものであると強調しているが、現在のاتラスは単一の発達段階（P21）および野生型マウスに限定されていることにも言及している。