Distinct evolutionary affinities of two transcript-supported non- AIM2 paralogues in the canine ALR/PYHIN repertoire

技術要約：イヌのALR/PYHINレパートリーにおける、2つの転写支持型非AIM2パラログの明確な進化系統的親和性

問題提起
歴史的にAIM2様受容体（ALR）と呼ばれてきたピリンおよびHINドメイン含有（PYHIN）ファミリーは、種特異的な急速な多様化を示すため、遺伝子名による哺乳類間でのオーソログ判定や機能予測は信頼性に欠ける。ヒトの遺伝子座は4つのHIN含有タンパク質（AIM2、IFI16、MNDA、PYHIN1）をコードし、マウスの遺伝子座は13個をコードしているが、イヌの系統ではAIM2の偽遺伝子化に伴い、2つの完全な遺伝子のみが保持されていると以前から報告されていた。しかし、これら2つのイヌの遺伝子座に対する既存のゲノム注釈は一貫性を欠いており、IFI16やMNDAといったラベルが隣接する遺伝子座に恣意的に割り当てられていた。さらに、近年の文献では、犬におけるDNA応答性表現型が「AIM2インフラマソーム」に起因するとされているが、ゲノム上の証拠はAIM2が非機能的であることを示唆している。現在解決されていない中心的な課題は、注釈ラベルに依存せず、2つの保持されたイヌ遺伝子のコーディング配列を定義するための、転写支持型の枠組みが欠如していることである。

方法論
著者らは、5つの高品質なイヌゲノムアセンブリ（UU_Cfam_GSD_1.0、ROS_Cfam_1.0、UMICH_Zoile_3.1を含む）と、公開されている末梢血単核細胞（PBMC）のRNAシーケンシングデータ、および比較ゲノミクスを統合し、イヌのPYHINレパートリーを再構築した。

• ゲノム再構築： 保存されたCADM3–SPTA1間区間を調査し、3つの焦点となる注釈レコード（候補A、B、C）を特定した。ドメイン構造は、NCBI Batch CD-Searchを用いて保存ドメインデータベース（CDD）に対して評価した。
• 転写検証： 8つのPBMCユニット（ガッディおよびラブラドール種、様々な刺激条件下）からのRNA-seqデータを、STARを用いて参照ゲノムにアラインメントした。特定のスプライスジャンクションおよびイントロン鎖に対するスプリットリードの支持を分析し、転写物モデルを検証し、アーティファクトを排除した。
• タンパク質再構築： ジャンクション支持およびクロスアセンブリの一致性に基づき、代表的なコーディング配列を選択した。候補Bについては、参照注釈とRNA-seq断片間の局所的なコーディング不一致を解決し、コンセンサス・タンパク質配列を定義した。
• 系統解析： ドメイン解決された最大尤度法による系統樹を、MAFFTおよびIQ-TREEを用いて、PYR（PYD）ドメインとHINドメインについて個別に構築した。全タンパク質のオーソロジーを仮定せずに、進化的な親和性を決定するために、多様な哺乳類から25のPYDおよび29のHIN配列を用いた。

主な結果

1. 2つの機能的遺伝子座の解明： 本研究は、転写的に支持された2つの完全なイヌPYHINコーディング遺伝子座が存在することを確認し、これらを暫定的に候補Aおよび候補Bと命名した。両者は完全なPYDおよびHINドメインをコードしている。
2. 完全なAIM2の除外： 潜在的なAIM2オーソログとして注釈されていた候補Cは、PYDを欠き、部分的で非特異的なHIN様一致のみを持つ。RNA-seq解析の結果、注釈されたスプライス鎖に対する一意のマッピングされたスプリットリードの支持は見られなかった。著者らは、完全なイヌAIM2コーディング遺伝子座が存在するという証拠はないと結論づけた。
3. 代表的配列：
   • 候補A： すべてのRNA-seqユニットにおいて強いジャンクション支持に基づき、468アミノ酸の代表配列（XP_038442325.1）を選択した。
   • 候補B： 441アミノ酸の「AN型」タンパク質を再構築した。この配列は、参照注釈に見られる残基37–38（CKからANへ）を修正したものであり、これは4つの独立した非参照アセンブリおよびRNA-seqの証拠と一致している。
4. 明確な進化系統的親和性： ドメイン解決された系統解析により、これら2つのイヌタンパク質は、ヒトのタンパク質と単一のオーソログ関係を共有していないことが明らかになった。
   • 候補A： そのHINドメインは、ヒトのIFI16とは異なるが、ネコ、ライオン、ハイエナの配列と親和性を共有する、IFI16関連/HIN2とラベル付けされた食肉目グループ内にクラスター化した。
   • 候補B： そのHINドメインは、より広範なCaniformia MNDA関連クレード内に位置する、Canidae特異的なMNDAに関連するグループ内にクラスター化した。
   • PYD解析： 両候補は他のCanidae MNDAラベル付き配列と共にグループ化され、AIM2クレードからは分離されたが、PYDツリーでは特定のパラログの同一性は解決されなかった。

意義および主張
本論文は、注釈によるラベルを超えて、イヌのPYHINレパートリーを解釈するための、配列定義された転写支持型の枠組みを確立する。著者らは以下のことを主張している。

• イヌのゲノムには、正確に2つの完全な非AIM2 PYHIN遺伝子が含まれており、AIM2遺伝子座は機能的なタンパク質を生成するという文脈において、決定的に偽遺伝子化している。
• 注釈由来の名前（例：「イヌのIFI16」や「イヌのMNDA」）は、この急速に多様化するファミリーにおいて、全タンパク質のオーソロジーの十分なプロキシ（代用指標）にはならない。
• これら2つのイヌタンパク質は、異なるドメインレベルの進化系統的親和性を有する。候補Aは食肉目のIFI16-HIN2系統に関連し、候補BはCanidaeのMNDA系統に関連している。
• これらの知見は、ドメインレベルの進化系統的親和性と全タンパク質のオーソロジーを区別するためのコンパクトな比較枠組みを提供する。著者らは、これらの配置が（ヒトMNDAと同様にIRF7の転写を制御する可能性など）機能研究のための仮説を提供するものである一方で、ヒトのパラログに対する機能的等価性を確立したり、DNA感知やインフラマソーム活性化のような特定のメカニズムを確定したりするものではないことを強調している。

本研究は、イヌにおけるDNA応答性表現型のAIM2への帰属は、提示されたゲノム証拠によって支持されないと結論づけており、今後のメカニズム研究は、推測されたヒトオーソログではなく、新たに定義された候補Aおよび候補Bの配列を用いる必要があるとしている。