YAP-antagonistic nanofiber-laminated tracheal stent abrogates in-stent restenosis pathological cascade

技術要約：在存内再狭窄を阻止するためのYAP拮抗性ナノファイバー積層気管ステント

問題の所在
気管内ステント内再狭窄（ISR）は、細菌の定着、慢性炎症、病的な血管新生、および線維化が連鎖的に発生する相乗的な病理学的カスケードによって引き起こされる、極めて重要な臨床的課題である。従来の薬物溶出ステントは、通常、単一の薬剤（パクリタキセルやラパマイシンなど）に依存しており、これらは細胞増殖を抑制するものの、ISRの多因子的な性質、特に初期段階の細菌感染と、それに続くHippoパスウェイのエフェクターであるYes関連タンパク質1（YAP）の活性化に対処することはできない。制御不能なYAPシグナル伝達は、線維芽細胞の活性化、細胞外マトリックスの沈着、および管腔の閉塞を促進する。そのため、感染から線維化に至る一連の病理学的プロセス全体を同期的に標的とするマルチファンクショナルなステントへの未充足のニーズが存在する。

方法論
著者らは、エレクトロスピニング技術を用いて、YAP拮抗性ナノファイバー積層気管ステント（PLVS）を開発した。このステントは、2種類の生理活性物質を共担持したポリ(L-乳酸)（PLLA）ナノファイバーでコーティングされた金属製自己拡張型ステント（SEMS）で構成されている。

1. ベルテポルフィン (VP): 後期の線維化カスケードを標的とし、YAP-TEAD複合体を阻害する。
2. アストラガロシドIV (AS): 初期段階の感染および炎症を標的とする、抗菌および免疫調節能を持つ天然モノマー。

研究では、包括的な評価戦略を用いた：

• 物理化学的特性評価: FTIR、ラマン分光法、SEM、および機械的試験を用い、薬物の封入、ナノファイバーの形態、および構造的完全性を検証した。
• in vitro アッセイ:
  • 抗菌性: メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）に対する増殖キネティクス、コロニー形成、および生/死染色。
  • 免疫調節: M1（iNOS）およびM2（CD206, ARG-1）マーカーによるマクロファージの極性化（RAW 264.7）の評価。
  • 抗血管新生/抗線維化: HUVECおよびヒト肺線維芽細胞（HPF）における増殖、移動、および管形成アッセイ、ならびにYAP、$\alpha$-SMA、COL-1の免疫蛍光染色。
  • 薬物放出: PBSおよび気管模擬液（TSF）中における30日間の放出キネティクスプロファイリング。
• in vivo 評価: 新西兰ラビット気管ステント留置モデルを用い、4週間にわたる治療効果を評価した。アウトカムには、管腔開通性を確認するためのCT画像、組織学的染色（H&H、マッソントリクローム）、および炎症、血管新生、線維化マーカーの免疫組織化学的解析が含まれる。
• トランスクリプトミクス: 気道リモデリング抑制の分子メカニズムを解明するために、RNAシーケンシング（RNA-seq）および遺伝子セットエンリッチメント解析（GSEA）を実施した。

主要な貢献

• 二剤併用による相乗的設計: 本研究は、ASが初期の感染・炎症フェーズ（MRSA抑制およびM1からM2へのマクロファージ極性化を介して）に対処し、VPが後期の線維化フェーズ（YAPシグナル伝達の阻害を介して）を標的とする、時間的に整合した組み合わせを導入した。
• エレクトロスパン・ナノファイバー・プラットフォーム: 初期バースト放出（0–10日）により急性炎症/感染を管理し、それに続く持続放出（11–30日）により長期的な抗線維化活性を実現する、均一で機械的に強固なナノファイバーコーティングの作製。
• メカニズムの洞察: PLVSステントが、ASによる上流の病原性NF-$\kappa$B/PI3K-AKT/TGF-$\beta$経路の遮断と、VPによる下流のYAP-TEAD相互作用の阻害を通じて、どのようにISRカスケードを断ち切るかを解明した。

結果

• 物理化学的特性: PLVSナノファイバーは、均一な直径（424–567 nm）、均質な薬物分布、および純粋なPLLAと比較して強化された引張強度を示した。これらは制御可能な分解率と、30日間で両薬剤ともに約54%の累積放出を示す二相性の放出プロファイルを示した。
• in vitro 有効性:
  • 抗菌性: PLVSおよびPLAS群は、MRSAの増殖を有意に抑制し（抑制率：PLVS 90.1%、PLAS 83.0%）、細菌膜の破裂を誘導した。
  • 免疫調節: PLVSは、マクロファージを炎症促進的なM1表現型から修復的なM2表現型へと効果的に極性化した。
  • 抗血管新生/抗線維化: PLVSはHUVECの増殖と管形成を著しく抑制し、HPFの増殖、移動、および筋線維芽細胞への分化（$\alpha$-SMAおよびCOL-1の減少）を抑制した。決定的なことに、PLVSは核内へのYAP蓄積を劇的に減少させた。
• in vivo 有効性: ラビットモデルにおいて、PLVSステントは気管の開通性を維持し、対照群と比較して肉芽組織の増殖を有意に減少させた。
  • 組織学: PLVS処理により、上皮増殖の厚さは1235.47 $\mu$m（PLLAコントロール）から481.07 $\mu$mへと減少し、コラーゲン容積率は31.54%から9.00%へと低下した。
  • 分子マーカー: PLVSは、炎症性IL-6、血管新生CD31/Ki67、および線維化$\alpha$-SMA/YAPの最も低い発現を示した。逆に、繊毛上皮マーカーであるFOXJ1をアップレギュレートしており、粘膜修復を示唆していた。
• トランスクリプトミクス: RNA-seqにより、前線維化（YAP1, MMPs）および前炎症性（CXCL5）遺伝子のダウンレギュレーションと、上皮の完全性に関わる遺伝子のアップレギュレーションが確認され、マルチパスウェイの相乗的な変調が検証された。

意義および主張
著者らは、PLVSステントがISRの病理学的カスケードを完全に断ち切ることで、気管狭窄の治療に向けたトランスレーショナルな候補となることを主張している。単一標的の従来のステントとは異なり、PLVSシステムは、時空間的に調整された二剤戦略を通じて、感染、炎症、血管新生、および線維化を同時に軽減する。本研究は、このアプローチが異常なYAPシグナル伝達を効果的に阻止し、気管の恒常性を回復させ、多機能薬物溶出ステントの新しい設計図を提供すると断言している。著者らは、4週間の観察期間やラビットモデルの使用といった限界を認め、さらなる検証のために長期的な分解特性や大型動物を用いた試験が必要であるとしている。