Hirudins, ornatins and piscicolins in representatives of freshwater and marine piscicolid leeches

技術要約：淡水および海洋性ピシコリ科ヒルにおけるヒルジン、オルナチン、およびピシコリン

問題提起
ピシコリ科のヒルは、淡水、汽水、および海洋環境に生息する魚類の血液を吸う外部寄生虫である。これらは病原体の媒介者として知られ、養殖業に経済的損失を与えるが、その生物活性を持つ抗凝固剤のレパートリーについては十分に解明されていない。海洋性ピシコリ科のヒルに関する過去のトランスクリプトーム研究では、様々な抗凝固剤（デスタベラーゼ、マニラーゼなど）が特定されているものの、ヒルジンについては不明瞭な結果が得られ、オルナチンの存在を示す証拠は見つからなかった。ヒルジンやオルナチンは他のヒル科（Glossiphoniidaeなど）では顕著に見られるが、ピシコリ科はすべての真のヒル類（Hirudinida）に対する姉妹群であるため、この科においてヒルジン超家族に属する遺伝子が存在するかどうかは不明であった。ヒルジン／オルナチン遺伝子の進化的な起源をヒル類の系統内で追跡するためには、この理解が極めて重要である。

方法論
本研究では、バイオインフォマティクス、分子生物学、および機能アッセイを組み合わせた多角的なアプローチを採用した：

• ゲノムおよびトランスクリプトーム解析： 著者らは、Piscicola geometra（淡水）および Branchellion lobata（海洋）の高精度な染色体レベルゲノムを用いた詳細なin silico解析を実施した。また、5種の海洋性ピシコリ科ヒル（Pontobdella macrothela, Cystobranchus vividus, Heptacyclus brunneus, Oxytonostoma typica, Pterobdella cf. abditovesiculata）の既存の唾液腺トランスクリプトームデータセットの再解析を行った。
• 探索戦略： 既知のヒルジンおよびオルナチン（特にPlacobdella costata由来）のクエリ配列を用いたtBLASTn検索を行い、相同遺伝子を特定した。
• 実験的検証：
  • 発現： 推定される遺伝子を合成し、Escherichia coli（株DH5αおよびSHuffle® T7）内で発現させた。
  • 精製： 組換えタンパク質は、Hisタグを除去するためのFactor Xaプロテアーゼ切断を含むシステムを用いて精製した。
  • 機能アッセイ：
    • トロンビン・タイム・テスト（TTT）： トロンビン阻害能（ヒルジン活性）を評価するために使用。
    • 光透過度アグリゴメトリー（LTA）： ADPによって刺激されたヒト血小板成分を用い、血小板凝集抑制（オルナチン活性）を測定するために使用。

主な貢献と結果

1. P. geometra におけるヒルジンおよびオルナチンの発見：

   • 淡水ヒルである P. geometra のゲノムには、多量体ヒルジン様因子（mHV/HLFs）をコードする8つの遺伝子と、4つのオルナチン遺伝子が含まれている。
   • オルナチン遺伝子は、染色体6上にタンデム配置でクラスター化している。
   • しかし、機能アッセイの結果、P. geometra 由来の単量体およびタンデムのオルナチンは、配列の相同性に基づいた期待に反して、血小板凝集抑制活性を示さなかった。

2. B. lobata における標準的なヒルジン／オルナチンの欠如：

   • 驚くべきことに、海洋性ヒルである B. lobata のゲノムには、標準的な多量体ヒルジンまたは単量体オルナチンをコードする検出可能な遺伝子が存在しなかった。
   • 同様に、B. lobata には既知のヒルジン／オルナチンファミリーに典型的な特定の遺伝子構造も見られなかった。

3. 「ピシコリン」の同定：

   • 新しいクラスの抗凝固因子である「ピシコリン（piscicolins）」が、B. lobata と P. geometra の両方で同定された。
   • 構造的相違： ヒルジンやオルナチンと同様に、ピシコリンはヒルジン超家族に属し、6つの高度に保存されたシステイン残基を含む。しかし、その遺伝子構造は異なる：
     • ヒルジン／オルナチンモジュールは2つのエキソンによってコードされる。
     • ピシコリンモジュールは3つのエキソンによってコードされる（ヒルジンモジュールの最初のエキソンが分割されている）。
     • これにより、ピシコリンモジュールでは、ヒルジンモジュールと比較して第3および第4のシステイン間の距離が長くなっている。
   • ゲノム構成： B. lobata において、ピシコリン遺伝子は染色体6に位置し、通常、1つの「ピシコリンモジュール」を2つの「ヒルジンモジュール」が挟むという三連構造を成している。
   • トランスクリプトームの証拠： ピシコリンをコードする転写産物は、様々な海洋性ピシコリ科のヒルのトランスクリプトームでも同定された（P. macrothela, C. vividus, H. brunneus, O. typica）。

4. ピシコリンの機能特性：

   • H. brunneus 由来の単量体ピシコリン（Hbru_Pisc1）は、典型的なRGD/KGDモチーフの代わりに、第5および第6のシステインの間にWGDモチーフを含んでいる。
   • 組換えHbru_Pisc1（天然のWGDおよび改変型RGDの両方）を用いた機能アッセイにより、ヒト血小板凝集に対して弱いが有意な抑制効果が示された。

5. 海洋性トランスクリプトームの再評価：

   • 海洋性ヒルのトランスクリプトームの再解析により、O. typica, C. vividus, P. macrothela などの種において、推定されるヒルジン/HLFおよびオルナチン変異体が存在することが確認され、海洋性ピシコリ科においてこれらの遺伝子が欠如しているという従来の仮定が修正された。

意義と主張
本論文は、その調査が、ピシコリ科における特定のヒルジン、オルナチン、および新規のピシコリン遺伝子ファミリーの存在を示す最初の包括的な証拠を提供すると主張している。過去の研究では、ヒルジンについては不確実な結果が得られ、オルナチンについてはこの科における証拠は見つかっていなかった。主な知見は以下の通りである：

• 進化的起源： P. geometra におけるヒルジン／オルナチン遺伝子の存在、および新規のピシコリンファミリーの同定は、ヒルジン超家族のすべての遺伝子の共通祖先が、真のヒル類（Hirudinida）の起源において既に存在していたことを示唆している。
• 構造的多様性： ピシコリンの発見は、ヒルジン超家族の構造的多様性を拡大するものであり、典型的なヒルジンやオルナチンの2エキソン構造とは異なる、独自の3エキソン遺伝子構造を浮き彫りにしている。
• 機能的多様性： 本研究は、配列の相同性が必ずしも同一の機能を保証するわけではないことを示している。P. geometra はオルナチン遺伝子を保有しているものの、実施されたアッセイでは不活性であった一方で、新規のピシコリンは測定可能な（ただし弱い）抗血小板活性を示した。

著者らは、ヒルジン超家族は血液吸血性のヒルにおいて広く普及し、進化的に古い特徴であり、ピシコリ科は当該遺伝子の進化の歴史を理解するための重要な鍵となる、と結論付けている。