Variance Analysis of Gut Microbiota and Metabolomics between Wild and Captive Pangolins

技術要約：野生および飼育下におけるセンザンコウの腸内細菌叢とメタボロミクスの変動解析

問題提起
センザンコウ（Manis pentadactyla および M. javanica）は、密猟や生息地の喪失により絶滅の危機に瀕しており、人工的な救護と繁殖が保全において不可欠となっている。しかし、飼育個体群は、代謝異常、免疫機能の低下、消化管のディスバイオーシス（菌交代症）を含む健康問題に頻繁に直面している。これらの問題は主に、現在の人工飼料が、野生下の食虫性（アリやシロアリを主食とする）の複雑な栄養生態を再現できていないことに起因している。先行研究では、飼育下のセンザンコウにおける細菌叢の分類学的変化が指摘されているものの、これらの微生物の変化を機能的な代謝結果や、種の違いおよび飼育環境の影響と結びつけた統合的な研究は不足している。本研究は、センザンコウの消化生理学および種固有の栄養要求事項に関する知識の空白を埋めるものである。

方法論
本研究では、3つの異なるグループ（野生の Manis pentadactyla [n=21]、飼育下の M. pentadactyla [n=18]、および飼育下の M. javanica [n=23]）を比較するために、統合的なマルチオミクス・アプローチを用いた。すべてのサンプルは、無菌的に採取された新鮮な糞便であり、−80°Cで保存された。

1. 腸内細菌叢プロファイリング： 糞便サンプルから総RNAを抽出し、PacBioプラットフォームを用いて細菌の16S rRNA遺伝子のV3–V4可変領域を増幅・配列決定した。データ解析には、品質フィルタリング、OTUクラスタリング（類似度97%）、およびRソフトウェアを用いた多様性解析（AlphaおよびBeta多様性）が含まれる。機能プロファイルはPICRUStr2を介して予測され、KEGGデータベースにマッピングされた。
2. 非標的メタボロミクス： 糞便代謝物をメタノール：水溶媒系を用いて抽出し、UPLC-MS/MSにより分析した。データ処理には、ピークのアライメント、正規化、およびSIMCAソフトウェアを用いた多変量統計解析（PCAおよびOPLS-DA）を行った。差次的代謝物は、VIP ≥ 1、フォールド変化の閾値、および P < 0.05 に基づいてスクリーニングされた。
3. ソースおよび相関解析： 系統的な追跡アプローチを用い、差次的代謝物を「宿主由来」、「食事/植物関連」、「微生物」、「外来性」の4つの起源に分類した。サンキーダイアグラムを用いてこれらのソースを可視化した。さらに、上位50の細菌属と83の共通差次的代謝物の間の相関ネットワークを構築し、有意な関連性を特定した。

主な結果

• 微生物叢の多様性と組成：

  • 多様性： 飼育下の M. pentadactyla は、同種の野生個体と比較してシンプソン多様性が有意に高く、これは均等性の低下を示唆している。飼育下の M. javanica は、飼育下の M. pentadactyla よりも微生物の豊富さ（Chao1および観察されたOTU）が有意に低かった。
  • 分類学的シフト： 野生の M. pentadactyla では、高タンパク質/動物性脂肪の食事に関連する分類群である Fusobacterium および Fusobacteriota が豊富であった。対照的に、飼育下の M. pentadacyla では、Romboutsia、Terrisporobacter、Cellulosilyticum といったセルロース分解性の Firmicutes 属が豊富であった。飼育下の M. javanica は、Lactococcus の濃縮を特徴としていた。
  • 種 vs 環境： PCoA解析により、宿主の種および飼育状態の両方がコミュニティ構造を有意に形成していることが確認され、2つの飼育種の間には明確な分離が見られた。

• メタボロミクス・プロファイル：

  • 差次的代謝物： 飼育状態は大幅な代謝変化を引き起こした。飼育下のセンザンコウでは、ポリアミン（スペルミン、スペルミジン）やストレス関連代謝物（例：イソブチリルカルニチン）の上昇が見られた。逆に、アルテミシニン、フォルモニノセチン、アナカディア酸などの生物活性天然物の著しい減少が認められた。これらは野生の食事（アリ、シロアリ、植物）に由来する可能性が高い。
  • ソース追跡： 83の共通差次的代謝物の大部分は、食事、食事と微生物の相互作用、または宿主の代謝に由来していた。抗炎症化合物（バイオアクティブ成分）の枯渇とストレスマーカーの蓄積は、代謝状態の変化を示唆している。

• 微生物叢と代謝物の相関：

  • 特定の細菌属が代謝シフトと強い相関を示した。例えば、飼育下で豊富であった Terrisporobacter は、アルテミシニンと正の相関を示し、イソブチリルカルニチンと負の相関を示した。野生下でより豊富であった Escherichia-Shigella は、炎症分子であるトロンボキサンB2と正の相関を示した。

主な貢献
本研究は、野生および飼育下の2種のセンザンコウにおいて、腸内細菌叢の再構成と糞便メタボロミクスの変化を結びつけた初の統合的解析を提供するものである。本研究は、飼育環境と野生環境を区別する特定の微生物分類群（Romboutsia、Terrisporobacter、Lactococcus）および代謝マーカー（ポリアミン、アルテミニシンの枯渇）を特定した。研究の結果、飼育環境は、肉食適応型のパターン（動物性タンパク質/脂質代謝）から、植物繊維ベースのパターンへと代謝シフトを強制し、それに伴って天然の抗炎症成分の喪失と代謝ストレスの兆候を伴うことを明らかにした。

意義と主張
著者らは、これらの知見が、飼育下のセンザンコウの腸内エコシステムを根本的に再構築し、「草食適応型」の代謝パターンをもたらし、それが個体の代謝ストレスや免疫不全を誘発する可能性があることを示していると主張している。本研究は、生物活性天然物（アルテミシニンのような）の枯渇とストレス代謝物（イソブチリルカルニチンのような）の蓄積が、飼育下の個体における生理学的不均衡の状態を示していると断定している。

本研究の意義は、飼育による生理学的不適合を理解するためのメカニズム的枠組みを提供することにある。著者らは、こうした知見がターゲットを絞ったマイクロバイオーム管理および栄養介入の基礎となることを示唆している。具体的には、将来の飼育管理戦略において以下のことが有効であると提案している：

1. 天然の食事防御を模倣するために、植物由来の抗炎症成分（フラボノイドなど）を組み込むこと。
2. 有益な短鎖脂肪酸産生菌をサポートするために、プレバイオティクスを用いた飼料の最適化を行うこと。
3. 天然の食虫習慣に合わせたプロバイオティクス・サプリメントを開発すること。

本論文は、このようなターゲットを絞った生物学的に裏付けられた介入が、代謝ストレスを緩和し、腸内恒常性を回復させ、免疫レジリエンス、福祉、および繁殖成功度を高め、それによって域外保全活動を支援できると結論付けている。