Transcriptomic Classification and Developmental Mapping of Canine Acute Leukemia Reveal Distinct Myeloid and Lymphoid Subgroups

技術要約：イヌ急性白血病のトランスクリプトーム分類および発生学的マッピング

問題提起
自然発症のイヌ急性白血病（cAL）は、正常な免疫系とヒトの疾患との臨床的な類似性を備えた、有望な自発的モデルである。しかし、cALの分子的な不均一性は十分に定義されておらず、精密な分類や種を越えた翻訳を妨げている。現在の免疫表現型解析への依存は、抗体の特異性の限界や種固有の分子参照データの欠如により、かなりの割合で「分類不能」な症例（急性分類不能白血病、AUL）を生じさせている。特にイヌ急性リンパ性白血病（ALL）における系統組成、とりわけT細胞前駆細胞とB細胞前駆細胞の区別については、分子レベルでの理解が不完全である。cALの遺伝子発 expression プロファイルを正常な造血参照集団にマッピングし、分化状態を定義して系統の曖昧さを解消することが喫緊の課題である。

方法論
本研究では、バルクRNAシーケンシングと単一細胞参照アトラスを統合したマルチモーダル・トランスクリプトーム・アプローチを採用した：

1. コホートおよび試料収集： 急性白血病と診断された110頭のイヌの末梢血白血球を用いてバルクRNAシーケンシングを実施した。対照群には、免疫表現型が正常な骨髄サンプル5検体と正常末梢血サンプル10検体を含めた。症例の選択は、犬種や年齢の制限を設けず、臨床歴、フローサイトメトリー、および芽細胞の形態に基づいて行った。
2. バルク・トランスクリプトミクス： 全RNAを抽出し、Illumina NovaSeq 6000を用いたペアエンド150bpシーケンシング（1サンプルあたり約1億5,000万リードをターゲット）のためにライブラリを調製した。データ処理はCanFam3.1ゲノムへのアライメント、品質管理、およびDESeq2を用いた差分的遺伝子発現（DGE）解析を行った。
3. 教師なしクラスタリング： 最も変動の大きい上位1,000個の遺伝子に基づき、階層的クラスタリングおよびK-meansクラスタリングを用いて、骨髄系およびリンパ系系統内の分子サブグループを定義した。
4. 発生学的マッピング： 白血病の状態を文脈化するため、著者らは3頭の健康なイヌから得られた正常イヌ胸腺の単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-seq）アトラスを作成した。この新しいアトラスは、既報のイヌ骨髄アトラスと統合された。
5. 検証および解析：
   • ドロップレットデジタルPCR（ddPCR）： 主要なマーカー遺伝子（例：DNTT, CD34）の検証に使用した。
   • 遺伝子セット富化解析（GSEA）および遺伝子セット変動解析（GSVA）： MSigDB遺伝子セットおよび単一細胞アトラスからのカスタムシグネチャーを用い、造血幹細胞（HSC）、前駆細胞、および系統特異的なプログラムの富化を評価した。
   • モジュール・スコアリング： クラスタ特異的なシグネチャーを胸腺および骨髄のアトラスに投影し、発生学的整合性を決定した。

主な結果

• 全般的な転写学的分岐： cAL検体は、正常な骨髄および末梢血の対照群とは転写学的に異なっていた。すべてのcAL症例において、白血病幹細胞（LSC）および初期前駆細胞プログラム（HSC, MPP/CMP）の富化と、成熟分化経路の抑制が見られた。これは、種を越えて共有される「未熟な」分子構造を示唆している。
• 系統の解明： 教師なしクラスタリングにより、2つの主要なグループが解明された：
  • 骨髄系グループ（グループ1）： 標準的な骨髄系遺伝子（ANPEP, LYZ, BPI）および炎症プログラムが富化している。
  • リンパ系グループ（グループ2）： 未熟なリンパ系およびT細胞系統の遺伝子（DNTT, RAG2, CD3D, ZAP70）が富化しており、B細胞系統の遺伝子は広範に抑制されている。
  • これらの分子グループは、暫定的なフローサイトメトリー診断（AML vs. ALL/AUL）と強い統計的関連を示した（χ² = 44.62, P < 0.0001）。
• 胸腺アトラスの構築： 新たに生成されたイヌ胸腺scRNA-seqアトラスは、初期胸腺前駆細胞（ETP）、ダブルネガティブ（DN）、ダブルポジティブ（DP）、およびシングルポジティブ（SP）のサブセットを含む、標準的なT細胞発生段階を解明することに成功した。
• 系統内不均一性：
  • 骨髄系サブグループ（n=56）： 3つの明確なクラスターが特定された：
    • クラスター1： 顆粒球への偏りを示す炎症状態（CXCL8, CSF3Rが富化）。成熟骨髄コンパートメントと一致する。
    • クラスター2： 単球／マクロファージまたは樹状細胞へのバイアスを特徴とし、自然免疫活性化および抗原提示調節因子（IRF5, BATF3）を特徴とする。
    • クラスター3： 発達的に原始的であり、初期前駆細胞およびリンパ系関連調節因子（LEF1, DNTT, RAG1）を発現。HSCおよび初期前駆細胞の状態と一致する。
  • リンパ系サブグループ（n=54）： 3つの明確なクラスターが特定された。これらはいずれもT細胞の発生プログラムを保持している：
    • クラスター1： 炎症特性およびRAS/MAPK負の調節因子が富化している。
    • クラスター2： 抗原提示および代謝フィットネス遺伝子が富化しており、初期の発達状態（HSC, CLP, ETP, DN）に対して最も広範な富化を示し、比較的原始的な発達状態と一致する。
    • クラスター3： HOX遺伝子を伴う顕著な前駆細胞様プログラムを特徴とするが、CD4およびCD8 SP胸細胞のシグネチャーと一致しており、より成熟したT細胞の発達状態と一致する。
• 臨床的相関： 転写サブグループは特定の末梢血フェノタイプと相関していた。例えば、骨髄系の「原始的」クラスター（クラスター3）は、CD34+細胞の割合が最も高く、顆粒球クラスターは表現型として正常な好中球の割合が最も高かった。

意義および主張
著者らは、本研究が保存された発生プログラムと系統特異的な不均一性を定義することにより、cALの分子学的枠組みを確立したと主張している。主な貢献は以下の通りである：

1. 精緻化された分類： 本研究は免疫表現型のみを超え、転写学を用いることで系統の曖昧さを解消し、異なる発達状態に対応する分子サブグループを定義している。
   ら
2. 発生学的文脈： バルクデータと単一細胞アトラス（特に新規のイヌ胸腺アトラス）を統合することで、cALのサブグループが単なる系統の同一性ではなく、分化の連続体（例：初期前駆細胞から成熟段階へ）上の位置によって区別されることを示している。
3. 翻訳的関連性： 本知見は、イヌとヒトの急性白血病間で共有される保存された調節モジュール（例：WT1, HOXA9, MEIS1）を強調している。これは、疾患メカニズムの研究および治療開発のための比較モデルとしてのcALの価値を強化するものである。
4. 将来の研究への基盤： 本研究は、将来の種を越えた研究をサポートするための参照枠組みおよびデータリソース（GEOアクセッション GSE345838 および GSE346138）を提供する。著者らは、転写サブグループは定義されているものの、それらの予後学的意義を完全に決定するためには、ゲノム改変、治療反応、および生存率との関連付けを行う将来の研究が必要であると控えめに述べている。