Endogenous Gdf15 activation limits adiposity and increases fecal energy excretion in mice

技術要約：内因性GDF15の活性化は、マウスにおける脂肪蓄積を抑制し、糞便へのエネルギー排泄を増加させる

問題提起
成長分化因子15（GDF15）は、後脳の受容体であるGFRALを介して食欲を抑制する能力から、肥満に対する潜在的な治療標的として浮上している。しかし、既存のエビデンスは、組換えヒトGDF15の薬理学的投与量や、生理学的レベルよりもはるかに高い（しばしば500倍もの）超生理学的な循環濃度を生じさせるトランスジェニックモデルに大きく依存している。これらのモデルは病態生理学的な状態を模倣しており、高生理学的範囲内での持続的な内因性GDF15の緩やかな上昇がもたらす代謝への影響を解明できていない。さらに、GDF15を自然に上昇させる介入（例：メトホルミン、運動、エンドトキシン）は多面的な反応を引き起こすため、エネルギーバランスに対するGDF15の特異的な寄与を分離することが困難である。選択的かつ持続的な内因性GDF15の上昇が、他のストレス信号とは独立して、エネルギーバランス、体重、および代謝を調節するのに十分であるかどうかという点において、決定的な知識の空白が存在する。

方法論
著者らは、ゲノム配列を変更することなく、マウスにおける内因性のGdf15発現を選択的にアップレギュレートするために、筋肉標的型のCRISPR活性化（CRISPRa）戦略を採用した。

• in vitro 最適化： C2C12ミオブラストを用い、Gdf15アイソフォームのプロモーター領域を標的とするガイドRNA（gRNA）をスクリーニングした。その結果、短鎖アイソフォームのプロモーターを標的とするgRNA（特にgRNA 5および7）がGDF15の分泌を最大化することを見出した。また、スプリット・インテインCRISPRaシステムが、フルレングスのシステムと同等の活性化レベルを達成可能であり、（アデノ随伴ウイルスが備える約4.7 kbのパッケージング制限と）互換性があることを検証した。
• in vivo 投与： チームは、筋肉向性AAVベクター（MyoAAV2a）を用いて、野生型（WT）、Gfralノックアウト（KO）、およびGdf15ノックアウト（KO）マウスに対して、全身的または筋肉内注射によりスプリットCRISPRaコンポーネントをデリバリーした。
• 実験モデル：
  • 予防モデル： 高脂肪・高ショ糖食（HFHSD）への切り替え前にCRISPAr-Gdf15処理を行い、食事誘発性肥満に対する抵抗性を評価した。
  • 治療モデル： 食事誘発性肥満が確立したマウスに対し、CRISPr-Gdf15を投与し、治療効果を評価した。
  • 機能喪失実験： Gfral KOおよびGdf15 KOマウスを用いた研究を行い、シグナリングへの依存性を決定した。
• フェノタイピング： 体組成（NMR）、食物摂取量、エネルギー消費量（間接熱量計法）、グルコース耐性試験、および自発的なホイール走行を含む包括的な代謝プロファイリングを実施した。
• メカニズム解析： 爆発熱量計法による糞便エネルギー排泄量の測定、盲腸内のマイクロバイオームに関する16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシング、および腸管の栄養吸収の変化を特定するための小腸（空腸および回腸）のRNA-seqを含めた解析を行った。

主な結果

• 持続的な生理学的上昇： CRISPRaによる活性化は、筋肉および循環系において、内因性GDF15を高生理学的範囲（コントロールと比較して約5〜8倍の、500〜800 pg/mL）へと正常に上昇させたが、肝臓や脂肪組織の発現には影響を与えなかった。
• 抗肥満効果： 予防および治療の両方の設定において、上昇した内因性GDF15は、WTマウスにおける食事誘発性の体重増加を抑制し、脂肪蓄積を減少させた。極めて重要なことに、この保護効果は、除脂肪量（リーンマス）を維持しつつ、脂肪量の蓄積を制限することによって達成された。
• GDF15-GFRAL軸への依存性： 抗肥満効果は、Gfral KOおよびGdf15 KOマウスにおいて消失した。これにより、この表現型には内因性のGdf15遺伝子座とGFRALシグナリングの両方が必要であることが確認された。
• エネルギーバランスのメカニズム：
  • 食物摂取量： 食物摂取量の減少は緩やかであり、実験間で一貫性に欠けていた。治療的な設定においては、食物摂取量はコントロール群と差がない場合もあった。
  • エネルギー消費量： 総エネルギー消費量に有意な変化は検出されなかった。
  • 糞便エネルギー排泄： 新たな知見として、処理されたWTマウスにおいて総糞便エネルギー排泄量が約50%増加した。この効果はGfralおよびGdf15 KOマウスでは認められず、GDF15-GFRAL依存的であることを示している。これは、食物摂取量に変化がない場合でも発生した。
• 腸管のリモデリング： 上昇したGDF15は以下の事項と関連していた：
  • マイクロバイオーム： 盲腸内のマイクロバイオームの多様性の増加、および、Bacteroidota（特にParabacteroidesおよびAlistipes）の減少とBacillota（特にFaecalibaculum）の増加を特徴とする組成の変化。
  • トランスクリプトミクス： 回腸のRNA-seqにより、成熟した腸細胞の代謝機能（脂質ハンドリングや酸化など）から、上皮の防御およびリモデリング状態への転換が明らかになった。アップレギュレートされた遺伝子には、抗菌ペプチド（Reg3g、Defa34など）、先天免疫メディエーター（Il18）、およびストレス応答遺伝子が含まれる。ダウンレギュレートされた遺伝子には、トランスポーターや代謝酵素が含まれる。
• 運動行動： 薬理学的な組換えGDF15は運動意欲を抑制するが、持続的な内因性GDF15の上昇は、WTマウスにおける自発的な走行距離を減少させなかった。

意義および主張
本論文は、エネルギーバランスの構成要素としての糞便エネルギー排泄の調節という、これまで未解明であったGDF15生物学の側面を特定したと主張している。著者らは以下の通り述べている：

1. 内因性上昇の十分性： 持続的かつ高生理学的な内因性GDF15の上昇は、超生理学的な薬理学的投与を必要とせずに、食事誘発性肥満を防止し、逆転させるのに十分である。
2. 新規メカニズム： 抗肥満効果は、食欲抑制やエネルギー消費量の増加のみによって駆動されるのではなく、糞便へのエネルギー排泄の増加を伴うものである。
3. 腸管軸： GDF15-GFRALシグナリングは、腸内マイクロバイオームと回腸上皮機能の協調的なリモデリングを駆動し、腸を栄養吸収能の低下と免疫防御の強化へとシフトさせる。
4. 治療的可能性： 内因性GDF15を標的とすることは、除脂肪量を維持し、かつ自発的な身体活動を抑制しない、肥満治療のための潜在的な戦略を提供する。これは、現在の薬理学的アプローチにおける限界に対処するものである。

著者らは、これらの知見が食欲調節を超えたGDF15の役割を支持するものであると結論付けており、糞便エネルギー排泄の増加を、GDF15によって制御される重要なエネルギー恒常性メカニズムとして位置づけている。彼らは、転写・微生物学的変化と糞便エネルギー排泄との間の因果関係の解明にはさらなる検討が必要であると述べているが、この表現型はGDF15-GFRAL軸に強固に依存している。