Comprehensive comparison of promoters from the Ethanol Utilization Pathway of Komagataella phaffii

技術要約：Komagataella phaffii のエタノール利用経路におけるプロモーターの包括的な比較

問題提起
Komagataella phaffii は、組換えタンパク質生産のための優れたホストであるが、伝統的にメタノール利用経路（MUT）およびメタノール誘導性 AOX1 プロモーター（PAOX1）に依存してきた。しかし、メタノールは工業規模のアプリケーションにおいて、安全性および毒性の観点から重大な懸念がある。エタノール（EtOH）は、より安全で再生可能な代替炭素源であるが、K. phaffii におけるエタノール利用経路（EUT）プロモーターの調節メカニズムは、依然として十分に解明されていない。特に、エタノール消費を担うアルコール脱水素酵素2（ADH2）と、エタノール生成を担うADH900との相互作用、およびそれらの遺伝的背景が異なる炭素源におけるプロモーター活性にどのように影響するかについては、系統的な評価が行われていない。

方法論
本研究では、遺伝子工学、代謝プロファイリング、およびハイスループットスクリーニングを組み合わせた系統的なアプローチを採用した：

• 菌株構築： 著者らは、野生型 K. phaffii CBS2612 から3種類のノックアウト株を作成した：
  • P5 ($\Delta$ADH2)： エタノール消費能が損なわれた株。
  • P107 ($\Delta$ADH900)： エタノール生成能が損なわれた株。
  • P109 ($\Delta$ADH2 $\Delta$ADH900)： エタノールの消費および生成の両方が不可能な株。
• レポーターシステム： 8つの天然EUT経路プロモーター（PADH2, PADH900, PALD4, PACS1, PACS2）およびコントロールプロモーター（PAOX1, PDAS1, PDAS2）を、eGFPレポーター遺伝子の上流にクローニングした。
• 培養およびスクリーニング： 4種類の炭素源（グルコース（BMD）、グリセロール（BMG）、エタノール（BME）、メタノール（BMM））を用いて、96ウェルプレートおよびシャークフラスコ内で菌株を培養した。培養はバッチフェーズの後、特定の炭素源レベルを維持するためのパルス供給を行った。
• 解析： 増殖は吸光度（OD600）によりモニタリングした。外液中の代謝物（エタノール、酢酸、アセトアルデヒド）はHPLCにより定量した。プロモーター活性は、細胞密度で正規化したeGFP蛍光を測定することによって評価した。

主な結果

• 代謝表現型：

  • ADH2の役割： ADH2はエタノール消費の主要な酵素である。$\Delta$ADH2（P5）および二重ノックアウト（P1나9）株は、唯一の炭素源としてのエタノールを用いた場合に増殖が著しく阻害され、P109は増殖が見られなかった。
  • ADH900の役割： ADH900はエタノール生成の中心である。$\Delta$ADH900（P107）株は、グルコース存在下でのエタノール生成量が野生型と比較して有意に低かったが、残留的な生成は見られた。
  • 機能的重複： 機能的な重複が存在する。$\Delta$ADH900株は依然として一部のエタノールを生成し、$\Delta$ADH2株は最小限の増殖を維持したことから、これら両酵素間には部分的な補完関係があることが示唆された。
  • 代謝物の蓄積： グルコース存在下では、すべての株が残留エタノールを生成した（野生型で最大約2.0 g/L）。エタノール添加培養において、野生型および$\Delta$ADH900株はエタノールを完全に代謝し、酢酸を蓄積したが、$\Delta$ADH2株はエタノールを消費することも酢酸を形成することもできなかった。

• プロモーター調節：

  • 最適なエタノール濃度： バイオマスおよびeGFP発現に対して、1% EtOHが最適であることが特定された。2%を超える濃度は、毒性のために増殖および発現を阻害した。
  • PADH2： 野生型において、PADH2はグルコース、グリセロール、エタノールの間で概ね構成的に発現していた。しかし、$\Delta$ADH2および二重ノックアウト株においては、PADH2による発現はよりエタノール応答的になった。エタノール消費能の欠如によりエタノールレベルが安定したことが、細胞あたりの転写活性を高める要因となったと考えられる。
  • PALD4： このプロモーターは、グルコース上の$\Delta$ADH2変異体、およびエタノール上の$\Delta$ADH900変異体においてアップレギュレートされた。著者らは、これが蓄積したエタノールまたはアセトアルデヒド／酢酸のような中間体に反応していると考えている。
  • PACS1/2： PACS1およびPACS2は、$\Delta$ADH900株をエタノールで増殖させた際にアップレギュレートされた。これは、還元経路の遮断による酢酸またはアセトアルデヒドレベルの上昇に起因すると考えられる。PACS1はPACS2よりも強いエタノール誘導性を示した。
  • PADH900： PADH900の発現は、エタノールの存在によって抑制された。エタノールを消費できない株（P5, P109）は、野生型と比較して有意に低いPADH900活性を示し、蓄積したエタノールが自身の生成機構を抑制するという負のフィードバックループを支持した。

意義および主張
本論文は、多様な遺伝的背景および炭素源にわたる、K. phaffii における天然EUTプロモーターの初の系統的な並行比較特性評価を提供すると主張している。本研究は以下の点を明らかにしている：

1. ADH2とADH900は機能的な重複を共有している： これは、両者が厳密に一方向性の酵素であるという見解に異を唱えるものであり、エタノール生成と消費の両方向において機能する。
2. 遺伝的背景がプロモーターの挙動を決定する： ADH2 または ADH900 のノックアウトは、EUTプロモーターの調節環境を変化させる。具体的には、エタノール消費の阻害は、PADH2およびPALD4の応答性を高める安定したエタノールレベルをもたらすが、一方で蓄積したエタノールはPADH900を抑制する。
3. エンジニアリングへの示唆： これらの知見は、K. phaffii のエンジニアリングに新たな洞察を与える。ADH2/ADH900 のバランスを操作することで、高濃度エタノールの毒性を回避しつつ、細胞の代謝状態を利用して、エタノール上での高いタンパク質発現収量に向けてEUTプロモーターをチューニングすることが可能となる。

著者らは、エタノールベースの持続可能なタンパク質生産のために、これら酵素とそれに対応するプロモーターの間の複雑な相互作用を理解することが不可欠であると結論付けている。