Genome-wide Association Study Reveals Candidate Genes Controlling Flavone Biosynthesis in Pepper Leaves (Capsicum annuum L.)

技術要約：ゲノムワイド関連解析によりトウガラシ葉におけるフラボン生合成を制御する候補遺伝子を解明

問題提起
トウガラシ属（Capsicum spp.）は世界的に重要な作物であるが、そのフラボノイド生合成に関する遺伝学的研究は、歴史的に果実中のアントシアニンにほぼ独占的に焦叠してきた。その結果、トウガラシの葉におけるフラボン変異の根底にある遺伝的構造は、ほとんど解明されていない。トウガラシの葉に含まれるフラボン誘導体（アピゲニンやルテオリン配糖体など）は、ヒトの健康への利益や植物のストレス保護機能を提供するが、これまでの研究でその構造は明らかにされているものの、それらの蓄積と多様化を制御する具体的な遺伝的調節因子は不明である。さらに、従来のQTLアプローチよりも高いマッピング解像度を提供するゲノムワイド関連解析（GWAS）が、葉のフラボノイドに対して適用されることは極めて稀であった。

方法論
本研究では、より広範なパネル（C. baccatum、C. frutescens、C. chinenseを含む154系統）から選抜された133のCapsicum annuum遺伝子型を用いてGWASを実施した。

• 表現型解析： 本研究では、同一の遺伝子型において事前に同定・定量された11種類のフラボン誘導体（様々なグリコシル、アピオシル、およびマロニル修飾を持つアピゲニンおよびルテオリン誘導体）の相対含有量データを用いた。
• ジェノタイピング： ジェノタイピング・バイ・シーケンシング（GBS）は、ApeKI制限酵素を用いて実施した。品質管理（MAF > 0.05、欠損データ < 30%）の後、C. annuumのサブセットに対して24,764個の高精度SNPを保持した。
• 集団構造： 主成分分析（PCA）およびアドミクスチャーモデリングにより、有意な集団構造が明らかになった。種間遺伝子型はC. annuumとは異なるクラスターを形成していた。偽陽性の関連を避けるため、主要なGWASは133のC. annuum遺伝子型に限定し、主成分を共変量として含めた。
• 統計モデル： 有意なSNP-形質関連を特定するために、2つのマルチローカスモデルであるBlinkとFarmCPUを用いた。有意なSNPは、ボンフェローニ補正およびベンジャミニ・ホックバーグの偽発見率（FDR）手順を用いて定義した。
• 候補遺伝子の同定： 有意なSNPは、その連鎖不平衡（LD）減衰ウィンドウ（C. annuumでは約120 kb）内で解析された。候補遺伝子の同定にあたっては、隣接配列（600 bp）を抽出し、CM334およびUCD10Xv1.1参照ゲノムに対してクエリを実行した後、機能注釈のためのBLAST検索を行った。

主な結果

• 代謝物変異と相関： フラボン濃度は遺伝子型間で広く変動していた。アピゲニン 7-O-(2''-O-アピオシル-6''-O-マロニル) グルコシド（AamG）およびルテオリン 7-O-(2''-O-アピオシル-6''-O-マロニル) グルコシド（LamG）が最も豊富であった。アピゲニン誘導体とルテオリン誘導体の間には強い負の相関（r = -0.86）が観察された一方、同一の構造系列内の代謝物同士は強い正の相関を示した。
• GWASシグナル： 二重モデルのアプローチにより、41個の有意なSNP（Blink）および45個（FarmCPU）が特定され、これら15個のSNPは両方のモデルに共通していた。これらのSNPは9種類のフラボン誘導体に関連していた。
• 候補遺伝子 F3'H： 最も顕著な知見は、両モデルによって特定された第3染色体上の多面的効果を持つローカス（SNP CHR3_270232022）である。このSNPは、**フラボノイド 3'-ヒドロキシラーゼ（F3'H）**をコードする候補遺伝子とLD関係にある。
  • このSNPは双方向の効果を示した。すなわち、すべての成分のアピゲニン誘導体に対しては負の関連を示し、すべての成分のルテオリン誘導体に対しては正の関連を示した。
  • ハプロタイプ解析により、アピゲニン優位の代謝物プロファイルとルテオリン優位の代謝物プロファイルに対応する、明確な遺伝子型グループ（CG vs. AA ハプロタイプ）が確認された。
  • 全ルテオリン誘導体と全アピゲニン誘導体の比率（TLAR）を表す複合形質も、この同じローカスにマッピングされており、F3'Hが分岐点となる調節因子であることを裏付けている。
• その他の構造的候補：
  • 第11染色体： アピゲニン誘導体に関連するSNPが、F3'5'H候補遺伝子の近傍に位置していた。
    。
  • 第7染色体： 2つのSNPが2OG-Fe(II) オキシゲナーゼスーパーファミリーのメンバーに関連しており、アピゲニン合成（例：フラボン合成酵素I）に関与している可能性がある。
  • 第10染色体： ルテオリン誘導体に関連するSNPが、**フラボノイド O-メチルトランスフェラーゼ（FOMT）**の候補にリンクされていた。
  • 第3染色体： SNPは**UDP-グルコシル転移酵素29（UGT29）および4-クマレート-CoAリガーゼ（4CL）**に関連していた。
• 調節および輸送の候補： 本研究では、転写因子（MYB, bHLH, NF-Y, ERF）およびFボックス/ケルチリピートタンパク質（タンパク質分解に関与）との有意な関連が特定された。さらに、ABCトランスポーター遺伝子（特にABCB4およびABCBファミリーのメンバー）が、有意なSNPのLDウィンドウ内に特定されており、液胞へのフラボノイド輸送における役割が示唆された。

意義と主張
著者らは、本研究がトウガラシの葉におけるフラボン多様性のための最初のゲノムワイドな遺伝的枠組みを提供するものであると主張している。主要な貢献は、アピゲニン由来およびルテオリン由来のフラボン誘導体の間の代謝流束を制御する分岐点調節因子として、F3'Hを特定したことである。相補的なGWASモデルとハプロタイプ解析および比率形質を用いた検証を活用することで、本研究は育種活動に向けた堅牢な候補遺伝子のセットを提供している。

本論文は、トウガラシの葉を生物活性フラボンの未利用の供給源として位置づけている。特定された遺伝的マーカーおよび候補遺伝子（構造酵素、調節因子、およびトランスポーターを含む）は、この組織を標的とした育種プログラムの基礎となる。著者らは、代謝物相関と既知の種における酵素機能によって支持される暫定的な生合成経路を提案しているものの、これらの候補のメカニズム的役割を確定するためには、機能検証（遺伝子発現解析、ノックアウト/過剰発現研究など）が必要であると強調している。本研究は、当該分野を支配してきた果実中心の研究を超えて、Capsicumにおけるフラボノイドの遺伝的調節を解明するための出発点として機能するものである。