Australian isolates of cell fusing agent virus and Culex flavivirus provide new tools to study insect-specific flaviviruses

技術要約：オーストラリア分離型の細胞融合エージェントウイルスおよびクエックス・フラビウイルスは、昆虫特異的フラビウイルス研究のための新たなツールを提供する

問題提起
細胞融合エージェントウイルス（CFAV）やクエックス・フラビウイルス（CxFV）のような昆虫特異的フラビウイルス（ISF）は、Orthoflavivirus属の進化や、病原性アルボウイルスの伝播を調節する可能性を理解する上で極めて重要である。これらは世界的に分布しているにもかかわらず、過去にメタゲノミクスによるCFAV RNAの検出があったにもかかわらず、オーストラリアの蚊からCFAVまたはCxFVのフィールド分離株が報告されたことはなかった。さらに、これらのウイルスの研究は、必須の研究ツール、具体的には、フィールド分離株に見られる共感染ウイルスの影響を排除せずに、宿主制限メカニズム、ウイルスの拡散、および抗原関係を調査するために必要な感染性クローンやウイルス特異的モノクローナル抗体（mAb）の欠如によって阻害されてきた。

方法論
研究者らは、オーストラリアのISFを単離、特性評価、およびツールの生成を行うために、多角的なアプローチを採用した：

• ウイルス単離： Aedes aegyptiのコロニー（クイーンズランド州ケーンズおよびイニフェイルの由来）と、野生で捕獲されたCulex quinquefasciatus（クイーンズランド州ブリスベン）をスクリーニングした。蚊のプールを均質化し、C6/36細胞単層に接種した。スクリーニングには、ウイルスの二本鎖RNA（dsRNA）を検出するためのMAVRIC ELISAシステムを用い、続いてパン・フラビウイルスおよびパン-ISFプライマーを用いたRT-PCRを行った。
• ゲノム特性評価： ポジティブな分離株に対し、完全なオープンリーディングフレーム（ORF）を得るためにディープシーケンシング（NovaSeq SP Illuminaプラットフォーム）を実施した。非翻訳領域（UTR）は、RNA環状化およびサンガーシーケンシングを介して解明した。系統樹は、最大尤度近似を用いたFastTreeを使用して構築した。
• 感染性クローンの生成： CPER（Circular Polymerase Extension Reaction）を用いて、CFAVおよびCxFVの感染性クローンを生成した。OpIE2プロモーターを用いた初期の試みは失敗したが、正確な5'末端切断を確実にするためのハンマーヘッドリボザイムと結合したAedes aegyptiポリユビキチン（AePUb）プロモーターを利用することで、成功裏に回収できた。NS4B/NS5接合部のサイレント変異は、クローンと野生型を区別するための遺伝的シグネチャーとして機能した。
• 抗体作製： 精製されたBinJ/CFAV-prMEキメラビリオンを用いてBALB/cマウスを免疫することにより、モノクローナル抗体を生成した。ハイブリドーマはELISAおよびウェスタンブロットによってスクリーニングされた。
• 抗原性および拡散解析： 古典的な、および二宿主関連のISFのパネルに対する固定細胞ELISAを用いて、抗原的な交差反応性を評価した。ウイルスの拡散を可視化するために、Ae. aegyptiの蚊にCFAV感染性クローンを胸腔内接種した。組織は、抗dsRNA mAbおよびウイルス特異的mAbを用いた免疫蛍光アッセイ（IFA）によって分析された。

主な結果

• 初のオーストラリア分離株： 本研究は、ケーンズのAe. aegyptiからCFAVを、ブリスベンのCx. quinquefasciatusからCxFVを単離することに成功し、これらはオーストラリアにおけるこれらのウイルスの初のフィールド分離株となった。
• 系統学的関係： オーストラリアのCFAV分離株は、北クイーンズランドおよび東南アジアで以前に検出された配列と密接に関連していた。ブリスベンのCxFV分離株は、メキシコおよびカンボジアの株と最も高い類似性を示した。
• 共感染： 野生型分離株のディープシーケンシングにより、他のウイルス（例：Phasi Charoen様ウイルス、Humaita-Tubiacangaウイルス、およびCulex iflavivirus）との共感染が明らかになった。これが、野生型ストックで観察された低い複製力価（10^3.9–10^5.3 TCID50/ml）に寄与していると考えられる。
• 感染性クローン： CFAVおよびオーストラリア株のCxFVの感染性クローンが初めて回収された。これらのクローンは効率的に複製し、C6/36細胞において特徴的な細胞変性効果（CPE）を誘導した（10^8 TCID50/mlを超える力価に達した）。
• モノクローナル抗体： CFAVに反応する5つのmAbが作製された。一つの特異的なmAb（CF3-3D1）は、広範な交差反応性を示し、CFAV、CxFV、Palm Creek virus (PCV)、Parramatta River virus (PaRV)、およびNiénokoué virus (NIEV)に結合した。この反応性は、Eタンパク質の融合ループにおける保存された「FKW」モチーフ（残基106–108）に関連していた。注目すべきことに、これらのmAbは固定された蚊の組織内のCFAVまたはCxFVタンパク質には結合しなかったが、抗dsRNA染色は広範な感染を可視化した。
• 拡散： 接種された蚊を用いた抗dsRNA mAb 2G4によるIFAは、CFAVが中腸、卵巣、および神経組織へ拡散することを示し、垂直伝播および超感染排除の可能性を示唆した。

意義および主張
著者らは、本研究がCFAVおよびCxFVの最初のオーストラリア分離株を提供し、既知の分布における地理的な空白を埋めるものであると主張している。本研究は、系統IのISFに関する堅牢な実験的ツールキットを確立している：

1. 感染性クローン： 初のCFAV感染性クローンおよびCPER由来のCxFVクローンであり、精密な遺伝的操作と、共感染によるアーティファクトのない宿主制限の研究を可能にする。
2. 抗原ツール： CFAVに特異的な一連のmAb（広範に反応するCF3-3D1を含む）を提供し、Eタンパク質融合ループを介して複数の古典的なISF間の抗原的保存性を特定する。
3. 生物学的知見： 生体内におけるCFAVの生殖組織および神経組織への拡散のデモンストレーションであり、垂直伝播におけるその役割を支持している。

論文は、これらのリソースがISFの生物学、宿主－ベクター相互作用、および生物制御戦略やワクチンおよび診断開発のプラットフォームとしてのISFの応用可能性に関する実験能力を大幅に拡大すると結論付けている。著者らは、AePUbプロモーターを用いたこれらのクローンの成功的な回収が、蚊特異的なウイルスに対する逆遺伝学システムにおけるプロモーター選択の重要性を強調していると述べている。