Prioritization of Androgenetic Alopecia-Associated Lactylation Sites through Multi-Omics Integration and the HybridKla Deep Learning Framework

技術要約：マルチオミクス統合とHybridKlaディープラーニングフレームワークによる、男性型脱毛症に関連するアセチル化部位の優先順位付け

問題提起
男性型脱毛症（AGA）は毛包の小型化を特徴とするが、毛包微小環境内におけるこのプロセスの分子基盤は完全には解明されていない。近年のシングルセルおよび空間トランスクリプトミクス研究により、変化した細胞状態や細胞間コミュニケーションが特定されているが、転写データのみではタンパク質の発現量や翻訳後修飾（PTM）の状態を捉えることはできない。特に、乳酸代謝と遺伝子制御を結びつける代謝的PTMであるリシンラクトイル化（Kla）がAGAにどのように寄与しているかは、ほとんど特徴付けられていない。課題は、修飾ペプチドの存在量の変化が、真の部位特異的な調節変化を反映しているのか、それとも単なる総タンパク質レベルの変化を反映しているのかを区別すること、そして全組織サンプルの中での複雑な状況下において、機能的研究のための特定のラクトイル化部位を優先順位付けすることにある。

方法論
本研究では、実験的プロファイリングとディープラーニングに基づく配列予測を組み合わせた、統合的なマルチオミクス・ワークフローを採用した：

1. マルチオミクス・データの生成:

   • シングルセル・トランスクリプトミクス: 3名のドナーから得られた、対となる6つの前頭部（FH）および後頭部（OC）の頭皮サンプルを解析した。特定のT細胞集団（クラスターC21）を抽出し、擬似バルク（pseudobulk）解析を行うことで、転写学的コンテキストを確立した。
   • プロテオミクスおよびラクトミクス: 2名のドナーから得られた、対となるFHおよびOCサンプルに対して、データ非依存的取得（DIA）質量分析を実施した。これには、総プロテオーム・プロファイリングと、抗リシンラクトイル化抗体を用いたラクトミクス・プロファイリングが含まれる。
   • 定量化: 総タンパク質およびラクトイル化部位の存在量を定量化、正規化し、領域間（FH vs. OC）で比較することで、総タンパク質と修飾ペプチドが相反する傾向を示す不一致なトレンドを特定した。

2. ディープラーニング・フレームワーク（HybridKlaの適応）:

   • モデル・アーキテクチャ: ESM2（タンパク質言語モデル）、LSTM（長短期記憶）ネットワーク、および手作りの物理化学的・組成的な特徴を統合したHybridKlaフレームワークを適応させた。
   • 表現形式の比較: ラクトイル化部位予測に対する最適な入力となるESM2表現戦略として、5つの戦略（CLSトークン、中央のリシン埋め込み、マスク平均プーリング、および結合）を評価した。
   • スコア融合: ESM2-E4、LSTM、および3つの手作り特徴モデル（AAINDEX、CKUSAAP、OBC）からの予測を融合させた「5D MetaModel」を構築した。
   • 適応戦略: 実験データの特異性に対する感度を高めるため、ESM2のバックボーンを凍結し、本研究独自のラクトミクス・データのサブセットを用いて分類ヘッドのみをファインチューニングした（ラボデータ適応）。

3. 候補の優先順位付け:

   • 候補は、以下の3つの収束する証拠に基づいて優先順位付けされた：(1) AGAに関連する組織における総タンパク質と修飾ペプチドの存在量の相反する領域的トレンド、(2) 適応させたディープラーニング・モデルによる高い予測スコア、(3) 高い質量分析サイト局在化確率。
   • 構造的コンテキストは、AlphaFoldモデルを用いて、残基の位置と局所的な信頼度（pLDDT）を可視化することで評価された。

主な結果

• 転写学的コンテキスト: C21 T細胞集団の擬似バルク解析により、「ヘルパー関連」モジュール（ZBTB7Bを含む）が、3名のドナーすべてにおいて前頭部で一貫した（ただし統計的に有意ではない）増加を示した。
• 不一致な存在量トレンド: 2組のドナーペアにおいて、総ZBTB7Bタンパク質存在量は前頭部で高かった（FH/OC比 = 1.806）のに対し、K206およびK212に関連するラクトイル化ペプチドは前頭部で低かった（FH/OC比はそれぞれ0.523および0.587）。この相反するトレンドは、総タンパク質解析よりも部位特異的な調査の必要性を浮き彫りにした。
• モデルの性能:
  • E4表現（中央のリシンとマスク平均プーリングの結合）は、ESM2のバリアントの中で最も高い平均ROC-AUC（0.8222）を達成した。
  • 5D MetaModelは、参照データセットにおいてROC-AUC 0.8281、PR-AUC 0.7984を達成した。
  • ラボデータ適応により、未知のタンパク質における陽性サイトの平均再現率（recall）が78.09%から90.75%へと大幅に向上したが、これは全体的な分類特異性ではなく、検出感度の向上であった。
• 候補の特定: K206およびK212の両方が、5D MetaModelによって陽性サイトとして予測された。質量分析の記録は、これらの部位におけるラクトイル化ペプチドの存在を、高い局在化確率（K206: 0.896–1.000、K212: 全ランを通じて1.000）とともに確認した。構造的可視化により、これらの残基がBTB/POZドメインとC2H2ジンクフィンガー領域の間の低信頼性領域に位置していることが示された。

主な貢献

• 部位特異的優先順位付けワークフロー: 本研究は、組織レベルのマルチオミクス観察（トランスクリプトミクス、プロテオミクス、ラクトミクス）を、残基特異的な配列予測と結びつけ、候補となるPTM部位を優先順位付けするワークフローを確立した。
• ZBTB7B K206/K212の特定: 本研究は、総タンパク質との相反する存在量トレンドというユニークなプロファイルに基づき、ZBTB7BのK206およびK212をAGAにおける候補ラクトイル化部位として優先順位付けした。
• 手法の適応: 学習済みのタンパク質言語モデル（HybridKla）を、分類ヘッドのファインチューニングを通じて適応させることで、同一のラボ由来の保持されたタンパク質セットに対する再現率を向上させる有用性を示した。
• コンテキストの統合: ZBTB7BのT細胞系統制御における確立された役割と、ラクトイル化による潜在的な翻訳後調節を結びつけ、毛包微小環境における免疫状態を調査するための分子的なエントリーポイントを提供した。

意義と主張
著者らは、本研究の主要な貢献は因果関係のある疾患メカニズムの確立ではなく、翻訳後調節を検討するための焦点化された基盤を提供することであると述べている。マルチオミクス・データとディープラーニングを統合することで、本研究はAGA研究を、発現の違いに関する広範な記述から、タンパク質のターンオーバー、調節複合体の形成、およびクロマチン制御に関するテスト可能な部位特異的な仮説へと進化させるものである。

論文は、自らの知見を「候補部位の優先順位付け」および「分子リード」として控えめに位置づけている。また、生物学的ドナー数の少なさ、健康な対照群の欠如、および全頭皮組織データでは修飾の細胞起源を決定的に割り当てられないことなどの限界を明確に認めている。研究は、特定されたZBTB7Bの総タンパク質とラクトイル化ペプチドの存在量の間の不一致は、これらの特定の残基がZBTB7Bの転写活性または毛包成長に影響を与えるかどうかを判断するための、さらなる標的検証を正当化するものであると結論付けている。