Molecular Characterisation of Biofilm-Forming, Multidrug-Resistant Bacteria from Water Distribution Systems, Choba, Rivers State, Nigeria

技術要約：ナイジェリア、リバース州チョバの水道配水系におけるバイオフィルム形成能を有する多剤耐性菌の分子学的特性解析

問題提起
安全な飲料水へのアクセスは、基本的人権であり、第6の持続可能な開発目標（SDGs）のターゲットでもある。しかし、水道配水系は病原性細菌が生存しやすく、それらが消毒剤や抗生物質から身を守るためのバイオフィルムを形成することが頻繁に認められている環境である。これまでの研究では、飲料水中の病原性種が特定されているものの、分離された菌株の具体的な毒性決定因子や薬剤耐性プロファイルを評価する研究には空白がある。本研究は、チョバ（ナイジェリア、リバース州）の公共水道配水系から分離された、バイオフィルム形成能を持つ多剤耐性（MDR）細菌を特性評価し、病原性菌株と非病原性菌株を区別し、公衆衛生上のリスクを評価する必要性に応えるものである。

方法論
本研究では、標準的な微生物学的手法、表現型解析、および分子生物学的手法を組み合わせて用いた：

• 試料採取: ナイジェリア、ポートハーコート大学のアブジャ・キャンパスから、12個の環境タップウォーター（蛇口水）試料を無菌的に採取した。
• 分離および同定: 28個の細菌分離株を回収し、生化学的試験（運動性、糖発酵、オキシダーゼ、カタラーゼ、ウレアーゼ、インドール試験を含む）によって確認した。
• 抗菌薬感受性試験: 様々な抗生物質に対する耐性プロファイルを決定するため、Mueller Hinton培地を用いたカービー・バウアー法（ディスク拡散法）を用いた。
• バイオフィルム評価: 以下の2つの表現型手法を用いた：
  1. コンゴーレッド寒天培地 (CRA): バイオフィルム形成を示す黒色の色素沈着を観察するため。
  2. チューブ法: リング形成を可視化し、クリスタルバイオレット染色によりバイオフィルムを定量化するため。
• 分子学的スクリーニング: 沸騰法を用いてゲノムDNAを抽出した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、4つの特定の毒性関連遺伝子（fimH（タイプ1線維）、papC（P線維）、afaCc（アフィブリアル・アドヘシン）、rmpA（カプセル関連調節因子））を検出した。
• 統計解析: Microsoft Excel 2010を用いてデータを分析した。

主な結果

• 細菌同定: 28個の分離株は様々な種で構成されており、Escherichia coli（大腸菌）とStreptococcus sp.（連鎖球菌属）が最も一般的であった（それぞれ21.4%）。Chromobacterium violaceum（クロモバクテリウム・ビオラセウム）は3.6%（1株）を占めた。
• 抗生物質耐性:
  • グラム陰性菌の分離株は、3つの特定の抗生物質に対して高い耐性（>80%）を示したが、3つのキノロン系（オフロキサシン、ナリジクス酸、レボフロキサシン）に対しては完全に感受性を示した。
  • グラム陽性菌の分離株は、より低い耐性率を示した（テストされた抗生物質の50%について15%未満）。
  • 全体として、グラム陰性菌の84.6%が多剤耐性（MDR）に分類されたのに対し、グラム陽性菌は33.3%であった。
• バイオフィルム形成: 唯一、Chromobacterium violaceum（PC19と指定）のみがバイオフィルム形成能を示した。これは、CRAによる黒色の色素沈着と、チューブアッセイにおける可視的な紫色のリングによって確認された。
• 分子学的知見:
  • PC19 (C. violaceum): 低い表現型抗生物質耐性（セフクロキシムにのみ耐性）を示したにもかかわらず、このバイオフィルム形成株はpapC遺伝子に対して陽性であった。afaCc、fimH、およびrmpA遺伝子は検出されなかった。
  • PC12 (Klebsiella pneumoniae): その多剤耐性（MDR）状態とバイオフィルム形成能の欠如により選定された。この分離株はfimHおよびpapCに対して陽性であったが、afaCcおよびrmpAに対しては陰性であった。
  • 特筆すべき点として、本研究では、必ずしも高度な多剤耐性表現型を示さない分離株においても、毒性関連遺伝子の存在が検出された。

主な貢献

• 新規の分離: 本研究は、ナイジェリアの公共水道配水系からChromobacterium violaceumの分離および分子学的同定に成功したことを報告しており、これはこの特定の文脈においてこれまで記録されていなかった発見である。
• 表現型と遺伝子型の相関: 本研究は、抗菌剤耐性と毒性の間の複雑な相互作用を浮き彫りにした。抗生物質に対して広範な多剤耐性を持たない場合でも、毒性関連遺伝子（特にC. violaceumにおけるpapC）を保有し、バイオフィルム形成能力を持つことが示された。
• 手法の適用: 本研究は、水中の病原性ポテンシャルを評価するためのツールとして、Congo Red Agarおよびチューブ法をPCRスクリーニングと併用することが有効であることを検証した。

意義および主張
著者らは、バイオフィルム形成能を持つChromobacterium violaceumが飲料水ネットワーク内に存在することは、微生物の持続性と消毒プロセスへの感受性低下のリスクを高めることを結論付けている。本研究は、抗生物質感受性が必ずしも低毒性を意味しないことを強調している。すなわち、感受性のある分離株であっても、管に付着しバイオフィルムを形成するための毒性決定因子を保持している可能性がある。

論文は、これらの知見が、表現型および分子学的な手法の両方を統合した継続的な微生物学的監視の必要性を裏付けるものであると主張している。このアプローチは、無害な環境細菌と、潜在的な病原能力を持つ細菌を区別するために不可欠なものとされている。