Characterization of the lysine forming saccharopine dehydrogenase LYS1 from filamentous fungi for plant food fermentation

기술 요약: 식물성 식품 발효를 위한 사카로핀 형성 Lysine-Forming Saccharopine Dehydrogenase LYS1의 특성 규명

문제 제기
라이신(Lysine)은 필수 아미노산이며, 균류 내에서의 생합성은 보존된 $\alpha$-아미노아디페이트(AAA) 경로를 통해 일어난다. 이 경로의 마지막 단계는 사카로핀을 L-라이신과 $\alpha$-케토글루타레이트로 전환하는 가역적 NAD$^+$/NADH 의존적 산화환원효소인 LYS1(EC 1.5.1.7)에 의해 촉매된다. 모델 효모인 Saccharomyces cerevisiae의 LYS1은 잘 규명되어 있으나, 템페, 미소, 치즈 생산과 같은 고체 상태 식품 발효 공정에 중요한 사상균(예: Aspergillus, Penicillium, Rhizopus) 유래 상동 단백질에 대한 지식 격차가 크다. 기존 문헌은 반응 방향성이 pH에 의존적임을 시사하지만, 정방향(라이신 형성) 반응에 대한 속도론적 특성 연구는 주로 최적이 아닌 중성 pH 조건에서 수행되어 왔다. 또한, 효모와 사상균 LYS1 효소 간의 생화학적 및 메커니즘적 차이는 아직 탐구되지 않았으며, 이는 식물 기반 발효 전략에서 라이신 생합성을 최적화하는 데 한계로 작용하고 있다.

연구 방법론
본 연구는 계통발생학, 재조합 단백질 발현, 생물물리학적 특성 규명, 속도론적 분석 및 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 결합한 다각적인 접근 방식을 채택하였다:

• 서열 및 구조 분석: 14종의 사상균 게놈에서 LYS1 상동체를 추출하여 BLASTp, 다중 서열 정렬(MAFFT), 계통수 재구성(IQ-TREE)을 통해 S. cerevisiae와 비교하였다. 3차원 구조는 AlphaFold3를 사용하여 예측하였으며, 구조적 유사성은 Foldseek을 통한 Local Distance Difference Test(LDDT)로 정량화하였다.
• 재조합 발현: S. cerevisiae, Aspergillus nidulans, Penicillium roqueforti, Rhizopus microsporus의 LYS1 유전자를 코돈 최적화하여 발현시켰다. S. cerevisiae LYS1은 E. coli에서 발현되었고, 사상균 유래 상동체들은 Pichia pastoris에서 발현되었다. 모든 단백질은 Ni-친화성 크로마토그래피를 통해 정제되었다.
• 생물물리학적 및 속도론적 특성 규명:
  • pH 프로파일: 정방향(사카로핀 $\to$ 라이신) 및 역방향(라이신 $\to$ 사카로핀) 반응 모두에 대해 pH 7–9 범위에서 효소 활성을 측정하였다.
  • 열 안정성: 표준 분석법과 nano differential scanning fluorimetry (nanoDSF)를 사용하여 최적 반응 온도와 녹는 온도($T_m$)를 결정하였다.
  • 속도론: 다양한 기질(사카로핀) 및 보조인자(NAD$^+$) 농도에서의 초기 속도 측정을 통해 정방향 반응의 겉보기 속도론적 파라미터($k_{cat}$, $K_M$, 촉매 효율)를 도출하였으며, 이를 Michaelis-Menten 방정식에 적합시켰다. 활성화 에너지($E_a$)는 Arrhenius plot을 통해 계산되었다.
• 분자 역학 (MD): apo, NAD$^+$-결합, 사카로핀-결합, 그리고 삼원 복합체(ternary complex) 상태에 대해 100 ns 시뮬레이션을 수행하였다. 주요 지표로는 RMSD, 활성 부위의 RMSF, 그리고 NAD$^+$ C4와 사카로핀 C8 원자 사이의 거리가 촉매 임계값(4.5, 4.0, 3.6 Å) 미만으로 떨어지는 프레임 빈도를 포함하였다. 단백질-리간드 접촉 점유율에 대해 주성분 분석(PCA)을 적용하였다.

주요 결과

• 서열 및 구조적 보존성: 계통 발생 분석 결과, S. cerevisiae와 사상균을 구분하는 뚜렷한 클레이드가 나타났으며, Aspergillus와 Penicillium이 가깝게 그룹화되었다. 상당한 서열 차이(사상균과 효모 간 약 50–55% 유사성)에도 불구하고, 전체 단백질 접힘(fold)은 매우 잘 보존되었다 (LDDT > 0.9). 핵심 촉매 잔기(Lys77, His96, Glu122)와 구조적 요소는 모든 상동체에서 보존되었다.
• pH 및 열역학적 의존성: 모든 상동체는 강한 pH 의존성을 보였다. 정방향 반응(라이신 형성)은 알칼리성 pH에서 유리하였고(최적 pH 9), 역방향 반응은 중성 pH에서 정점에 도달하였다. 열역학적 제약과 일치하게, 역방향 반응은 모든 효소와 pH 조건에서 정방향 반응보다 현저히 높은 $k_{cat}$ 값을 나타냈다.
• 속도론적 차이:
  • S. cerevisiae LYS1은 가장 높은 촉매 회전수($k_{cat} \approx 2.34$ s$^{-1}$)와 가장 낮은 활성화 에너지($E_a \approx 13.1$ kJ/mol)를 보였다.
  • A. nidulans와 P. roqueforti는 중간 정도의 활성을 보였다.
  • R. microsporus LYS1은 현저히 낮은 활성($k_{cat} \approx 0.05$ s$^{-1}$)과 가장 높은 활성화 에너지($E_a \approx 53.3$ kJ/mol)를 나타냈다. 낮은 $k_{cat}$에도 불구하고, R. microsporus는 두 기질 모두에 대해 더 낮은 겉보기 $K_M$ 값을 보여, 강력한 결합력은 있으나 촉매 단계에서 병목 현상이 있음을 시사했다.
• 열적 특성: S. cerevisiae LYS1은 가장 높은 녹는 온도($T_m \approx 60^\circ$C)와 최적 반응 온도($45^\circ$C)를 가졌다. 사상균 유래 효소들은 이들의 모체 생물 성장 온도와 상관관계가 있는 더 낮은 열 안정성과 최적 온도(35–40°C)를 보였다.
• 분자 역학 통찰:
  • 구조적 샘플링: 더 활발한 상동체(S. cerevisiae, A. nidulans)는 덜 활발한 R. microsporus보다 근접 반응 기하구조(NAD$^+$ C4에서 사카로핀 C8 거리 < 4.0 Å)를 더 자주 샘플링하였다.
  • 유연성: S. cerevisiae는 apo 상태에서 더 단단한 백본을 보인 반면, 사상균은 더 높은 유연성을 보였다. 삼원 복합체 형성 시, 사상균은 효모 효소에 비해 활성 부위 RMSF가 더 급격히 감소(강직도 증가)하였다.
  • 접촉 조직화: 잔기-리간드 접촉에 대한 PCA 결과 뚜렷한 상호작용 패턴이 드러났다. R. microsporus는 NAD$^+$와의 지속적인 접촉 수가 가장 적었으며, 이는 효과적인 보조인자 배치를 저해할 가능성이 있다. R. microsporus의 특정 치환(Ala289Cys)이 하이드라이드 전달 영역 근처의 접촉을 방해하는 잠재적 요인으로 식별되었다.

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 식품 발효와 관련된 사상균의 라이신 생합성을 이해하기 위한 메커니즘적 및 속도론적 근거를 제공한다고 주장한다. 주요 주장은 다음과 같다:

1. 생화학적 다양성: 높은 구조적 보존성에도 불구하고, LYS1 효소들은 생화학적으로 다양하며, 특히 R. microsporus는 Ascomycete 상동체들과 비교하여 뚜렷한 촉매 병목 현상을 보인다.
2. 열역학적 제약: 모든 상동체에서 나타나는 역방향 반응에 대한 강한 선호도는 라이신 생합성의 정방향 흐름이 열역학적으로 불리하며, 이를 진행시키기 위해서는 세포 내 대사물 농도와 경로 결합(pathway coupling)에 의존해야 함을 시사한다.
3. 속도론적 차이의 메커니즘적 기원: 관찰된 속도론적 격차는 촉매 스캐폴드의 상실 때문이 아니라, 삼원 복합체의 조직화 및 안정성 차이에 기인한다. 구체적으로, 덜 활발한 R. microspisius 효소는 생산적인 단백질-리간드 접촉의 빈도와 촉매 거리를 샘플링하는 능력이 낮다.
4. 발효에 대한 시사점: 데이터는 R. microsporus가 Aspergillus나 Penicillium 종에 비해 라이신 생산 능력에 내재적인 한계가 있을 수 있음을 시사한다. 따라서 이러한 결과는 식물 기반 식품의 라이신 함량을 높이기 위한 고체 상태 발효용 균주 선택에 정보를 제공할 수 있다. 본 연구는 정방향 반응이 알칼리 조건에서 유리함을 확인하였으며, 이는 생체 내(in vivo)에서 최적의 경로 기능을 위한 특정 세포 내 위치(예: 퍼옥시좀) 요구 사항을 암시할 수 있다.