Characterization of the lysine forming saccharopine dehydrogenase LYS1 from filamentous fungi for plant food fermentation

Resumo Técnico: Caracterização da Lisina-Formadora Sacaropina Desidrogenase LYS1 de Fungos Filamentosos para Fermentação de Alimentos de Origem Vegetal

Definição do Problema
A lisina é um aminoácido essencial, e sua biossíntese em fungos ocorre via a via conservada do $\alpha$-aminoadipato (AAA). A etapa final desta via é catalisada pela LYS1 (EC 1.5.1.7), uma oxidorredutase reversível dependente de NAD$^+$/NADH que converte sacaropina em L-lisina e $\alpha$-cetoglutarato. Embora a enzima LYS1 do levedo modelo Saccharomyces cerevisiae tenha sido caracterizada, existe uma lacuna significativa de conhecimento em relação aos homólogos de fungos filamentosos (ex: Aspergillus, Penicillium, Rhizopus), que são críticos para processos de fermentação de alimentos em estado sólido, como a produção de tempeh, missô e queijos. A literatura existente sugere que a direcionalidade da reação é dependente do pH, contudo, as caracterizações cinéticas da reação direta (formação de lisina) foram realizadas majoritariamente sob condições subótimas de pH neutro. Além disso, as diferenças bioquímicas e mecanísticas entre as enzimas LYS1 de levedos e de fungos filamentosos permanecem inexploradas, limitando a capacidade de otimizar a biossíntese de lisina em estratégias de fermentação de base vegetal.

Metodologia
O estudo empregou uma abordagem multifacetada combinando filogenética, expressão de proteína recombinante, caracterização biofísica, análise cinética e simulações de dinâmica molecular (MD):

• Análise de Sequência e Estrutura: Homólogos de LYS1 foram recuperados de 14 genomas de fungos filamentosos e comparados com S. cerevisiae usando BLASTp, alinhamento múltiplo de sequências (MAFFT) e reconstrução filogenética (IQ-TREE). Estruturas tridimensionais foram preditas usando AlphaFold3, e a similaridade estrutural foi quantificada pelo Teste de Diferença de Distância Local (LDDT) via Foldseek.
• Expressão Recombinante: Genes para LYS1 de S. cerevisiae, Aspergillus nidulans, Penicillium roqueforti e Rhizopus microsporus foram codificados de forma otimizada e expressos. O LYS1 de S. cerevisiae foi expresso em E. coli, enquanto os homólogos de fungos filamentosos foram expressos em Pichia pastoris. Todas as proteínas foram purificadas via cromatografia de afinidade por Ni.
• Caracterização Biofísica e Cinética:
  • Perfil de pH: A atividade enzimática foi medida entre pH 7–9 para ambas as reações direta (sacaropina $\to$ lisina) e reversa (lisina $\to$ sacaropina).
  • Estabilidade Térmica: Temperaturas ótimas de reação e temperaturas de fusão ($T_m$) foram determinadas usando ensaios padrão e nano diferencial scanning fluorimetry (nanoDSF).
  • Cinética: Parâmetros cinéticos aparentes ($k_{cat}$, $K_M$, eficiência catalítica) para a reação direta foram derivados de medições de taxa inicial em concentrações variadas de substrato (sacaropina) e cofator (NAD$^+$), ajustados à equação de Michaelis-Menten. Energias de ativação ($E_a$) foram calculadas via gráficos de Arrhenius.
• Dinâmica Molecular (MD): Simulações (100 ns) foram realizadas nos estados apo, ligado ao NAD$^+$, ligado à sacaropina e complexo ternário. Métricas principais incluíram o Desvio Padrão Quadrático Médio (RMSD), a Flutuação Quadrática Média (RMSF) do sítio ativo e a frequência de frames onde a distância entre os átomos C4 do NAD$^+$ e C8 da sacaropina caiu abaixo dos limiares catalíticos (4,5, 4,0 e 3,6 Å). A Análise de Componentes Principais (PCA) foi aplicada às ocupações de contato proteína-ligante.

Principais Resultados

• Conservação de Sequência e Estrutura: A análise filogenética revelou clados distintos separando S. cerevisiae de fungos filamentosos, com Aspergillus e Penicillium agrupando-se proximamente. Apesar da divergência significativa de sequência (similaridade de aproximadamente 50–55% entre fungos filamentosos e levedos), o dobramento proteico geral foi altamente conservado (LDDT > 0,9). Resíduos catalíticos críticos (Lys77, His96, Glu122) e elementos estruturais foram preservados em todos os homólogos.
• Dependência de pH e Termodinâmica: Todos os homólogos exibiram forte dependência de pH. A reação direta (formação de lisina) foi favorecida em pH alcalino (ótimo em pH 9), enquanto a reação reversa atingiu o pico em pH neutro. Consistente com as restrições termodinâmicas, a reação reversa apresentou valores de $k_{cat}$ significativamente maiores do que a reação direta em todas as enzimas e condições de pH testadas.
• Diferenças Cinéticas:
  • O LYS1 de S. cerevisiae demonstrou a maior rotatividade catalítica ($k_{cat} \approx 2,34$ s$^{-1}$) e a menor energia de ativação ($E_a \approx 13,1$ kJ/mol).
  • A. nidulans e P. roqueforti mostraram atividade intermediária.
  • O LYS1 de R. microsporus exibiu atividade significativamente reduzida ($k_{cat} \approx 0,05$ s$^{-1}$) e a maior energia de ativação ($E_a \approx 53,3$ kJ/mol). Apesar do menor $k_{cat}$, o R. microsporus apresentou valores de $K_M$ aparente mais baixos para ambos os substratos, sugerindo uma ligação forte, mas um gargalo catalítico.
• Propriedades Térmicas: O LYS1 de S. cerevisiae possui a maior temperatura de fusão ($T_m \approx 60^\circ$C) e temperatura ótima de reação ($45^\circ$C). As enzimas de fungos filamentosos mostraram menor estabilidade térmica e ótimos mais baixos (35–40°C), correlacionando-se com as temperaturas de crescimento conhecidas de seus organismos de origem.
• Insights de Dinâmica Molecular (MD):
  • Amostragem Conformacional: Homólogos mais ativos (S. cerevisiae, A. nidulans) amostraram geometrias próximas à reatividade (distâncias NAD$^+$ C4 para sacaropina C8 < 4,0 Å) com maior frequência do que o R. microsporus.
  • Flexibilidade: O S. cerevisiae apresentou um esqueleto mais rígido no estado apo, enquanto os fungos filamentosos exibiram maior flexibilidade. Após a formação do complexo ternário, os fungos filamentosos mostraram uma diminuição acentuada na RMSF do sítio ativo (aumento da rigidez) em comparação com a enzima do levedo.
  • Organização de Contato: A PCA dos contatos resíduo-ligante revelou padrões de interação distintos. O R. microsporus apresentou o menor número de contatos persistentes com o NAD$^+$, potencialmente dificultando o posicionamento eficaz do cofator. Uma substituição específica (Ala289Cys) no R. microsporus foi identificada como um fator potencial de disrupção de contatos próximos à região de transferência de hidreto.

Significância e Alegações
Os autores alegam que este estudo fornece uma base mecânica e cinética para compreender a biossíntese de lisina em fungos filamentosos relevantes para a fermentação de alimentos. As principais alegações são:

1. Diversidade Bioquímica: Apesar da alta conservação estrutural, as enzimas LYS1 de fungos filamentosos são bioquimicamente diversas, com o R. microsporus exibindo um gargalo catalítico distinto em comparação aos homólogos de Ascomycetes.
2. Restrições Termodinâmicas: A forte preferência pela reação reversa em todos os homólogos sugere que o fluxo direto da biossíntese de lisina é termodinamicamente desfavorável e provavelmente depende de concentrações de metabólitos intracelulares e do acoplamento da via para prosseguir.
3. Origem Mecanística das Diferenças Cinéticas: A divergência cinética observada é atribuída não a uma perda do arcabouço catalítico, mas a diferenças na organização e estabilidade do complexo ternário. Especificamente, a frequência de contatos proteína-ligante produtivos e a capacidade de amostrar distâncias catalíticas são menores no LYS1 do R. microsporus.
4. Implicações para a Fermentação: Os dados sugerem que o R. microsporus pode possuir limitações inerentes na capacidade de produção de lisina em comparação com espécies de Aspergillus ou Penicillium. Consequentemente, estes achados podem informar a seleção de linhagens fúngicas para fermentações em estado sólido visando aumentar o conteúdo de lisina em alimentos de base vegetal. O estudo confirma que a reação direta é favorecida em condições alcalinas, o que pode implicar requisitos específicos de localização subcelular (ex: peroxissomos) para a função ótima da via in vivo.