Characterization of the lysine forming saccharopine dehydrogenase LYS1 from filamentous fungi for plant food fermentation

Resumen Técnico: Caracterización de la Lisina-Formadora de Sacaropina Deshidrogenasa LYS1 de Hongos Filamentosos para la Fermentación de Alimentos de Origen Vegetal

Planteamiento del Problema
La lisina es un aminoácido esencial, y su biosíntesis en hongos ocurre a través de la vía conservada del $\alpha$-aminoadipato (AAA). El paso final de esta vía es catalizado por LYS1 (EC 1.5.1.7), una oxidorreductasa reversible dependiente de NAD$^+$/NADH que convierte la sacaropina en L-lisina y $\alpha$-cetoglutarato. Si bien el enzima LYS1 de la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae ha sido caracterizado, existe una brecha de conocimiento significativa respecto a los homólogos de hongos filamentosos (p. ej., Aspergillus, Penicillium, Rhizopus), los cuales son críticos para los procesos de fermentación de alimentos en estado sólido como la producción de tempeh, miso y quesos. La literatura existente sugiere que la direccionalidad de la reacción depende del pH, aunque las caracterizaciones cinéticas de la reacción hacia adelante (formación de lisina) se han realizado mayoritariamente bajo condiciones de pH neutro subóptimas. Además, las diferencias bioquímicas y mecánicas entre las enzimas LYS1 de la levadura y de los hongos filamentosos permanecen inexploradas, lo que limita la capacidad de optimizar la biosíntesis de lisina en estrategias de fermentación de base vegetal.

Metodología
El estudio empleó un enfoque multifacético que combina filogenética, expresión de proteínas recombinantes, caracterización biofísica, análisis cinético y simulaciones de dinámica molecular (MD):

• Análisis de Secuencia y Estructura: Se recuperaron homólogos de LYS1 de 14 genomas de hongos filamentosos y se compararon con S. cerevisiae mediante BLASTp, alineamiento de secuencias múltiples (MAFFT) y reconstrucción filogenética (IQ-TREE). Las estructuras tridimensionales se predijeron mediante AlphaFold3, y la similitud estructural se cuantificó utilizando el Test de Diferencia de Distancia Local (LDDT) vía Foldseek.
• Expresión Recombinante: Los genes para LYS1 de S. cerevisiae, Aspergillus nidulans, Penicillium roqueforti y Rhizopus microsporus fueron optimizados en codones y expresados. El LYS1 de S. cerevisiae se expresó en E. coli, mientras que los homólogos de hongos filamentosos se expresaron en Pichia pastoris. Todas las proteínas fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad por Ni.
• Caracterización Biofísica y Cinética:
  • Perfil de pH: La actividad enzimática se midió en un rango de pH 7–9 para ambas reacciones: la directa (sacaropina $\to$ lisina) y la inversa (lisina $\to$ sacaropina).
  • Estabilidad Térmica: Se determinaron las temperaturas óptimas de reacción y las temperaturas de fusión ($T_m$) utilizando ensayos estándar y fluorimetría de dispersión de calor diferencial nano (nanoDSF).
  • Cinética: Los parámetros cinéticos aparentes ($k_{cat}$, $K_M$, eficiencia catalítica) para la reacción directa se derivaron de mediciones de velocidad inicial a concentraciones variables de sustrato (sacaropina) y cofactor (NAD$^+$), ajustándolos a la ecuación de Michaelis-Menten. Las energías de activación ($E_a$) se calcularon mediante gráficos de Arrhenius.
• Dinámica Molecular (MD): Se realizaron simulaciones (100 ns) sobre los estados apo, unido a NAD$^+$, unido a sacaropina y el complejo ternario. Las métricas clave incluyeron la Desviación de la Raíz Cuadrática Media (RMSD), la Fluctuación de la Raíz Cuadrática Media (RMSF) del sitio activo, y la frecuencia de fotogramas donde la distancia entre el C4 de NAD$^+$ y el C8 de la sacaropina cayó por debajo de los umbrales catalíticos (4.5, 4.0 y 3.6 Å). Se aplicó el Análisis de Componentes Principales (PCA) a las ocupaciones de contacto proteína-ligando.

Resultados Clave

• Conservación de Secuencia y Estructura: El análisis filogenético reveló clados distintos que separan a S. cerevisiae de los hongos filamentosos, con Aspergillus y Penicillium agrupándose estrechamente. A pesar de la significativa divergencia de secuencia (aprox. 50–55% de similitud entre hongos filamentosos y la levadura), el plegamiento proteico general fue altamente conservado (LDDT > 0.9). Los residuos catalíticos críticos (Lys77, His96, Glu122) y los elementos estructurales se preservaron en todos los homólogos.
• Dependencia de pH y Termodinámica: Todos los homólogos exhibieron una fuerte dependencia del pH. La reacción directa (formación de lisina) fue favorecida en pH alcalino (óptimo en pH 9), mientras que la reacción inversa alcanzó su máximo en pH neutro. En consistencia con las restricciones termodinámicas, la reacción inversa mostró valores de $k_{cat}$ significativamente mayores que la reacción directa en todos los enzimas y condiciones de pH probadas.
• Diferencias Cinéticas:
  • El LYS1 de S. cerevisiae demostró la mayor rotación catalítica ($k_{cat} \approx 2.34$ s$^{-1}$) y la menor energía de activación ($E_a \approx 13.1$ kJ/mol).
  • A. nidulans y P. roqueforti mostraron una actividad intermedia.
  • El LYS1 de R. microsporus exhibió una actividad significativamente reducida ($k_{cat} \approx 0.05$ s$^{-1}$) y la mayor energía de activación ($E_a \approx 53.3$ kJ/mol). A pesar de su menor $k_{cat}$, R. microsporus presentó valores de $K_M$ aparente más bajos para ambos sustratos, lo que sugiere una unión fuerte pero un cuello de botella catalítico.
• Propiedades Térmicas: El LYS1 de S. cerevisiae poseía la mayor temperatura de fusión ($T_m \approx 60^\circ$C) y temperatura de reacción óptima (45°C). Los enzimas de hongos filamentosos mostraron una menor estabilidad térmica y óptimos de 35–40°C, lo cual correlaciona con las temperaturas de crecimiento de sus organismos de origen.
• Perspectivas de la Dinámica Molecular:
  • Muestreo Conformacional: Los homólogos más activos (S. cerevisiae, A. nidulans) muestren geometrías cercanas a la reactividad (distancias NAD$^+$ C4 a sacaropina C8 < 4.0 Å) con mayor frecuencia que el R. microsporus menos activo.
  • Flexibilidad: S. cerevisiae mostró un esqueleto más rígido en el estado apo, mientras que los hongos filamentosos exhibieron mayor flexibilidad. Tras la formación del complejo ternario, los hongos filamentosos mostraron una disminución más pronunciada en el RMSF del sitio activo (mayor rigidización) en comparación con el enzima de la levadura.
  • Organización de Contactos: El PCA de los contactos residuo-ligando reveló patrones de interacción distintos. R. microsporus mostró el menor número de contactos persistentes con NAD$^+$, lo que potencialmente dificulta el posicionamiento efectivo del cofactor. Se identificó una sustitución específica (Ala289Cys) en R. microsporus como un factor potencial que disrumpe los contactos cerca de la región de transferencia de hidruro.

Significancia y Afirmaciones
Los autores afirman que este estudio proporciona una base mecánica y cinética para comprender la biosíntesis de lisina en hongos filamentosos relevantes para la fermentación de alimentos. Las afirmaciones clave son:

1. Diversidad Bioquímica: A pesar de la alta conservación estructural, las enzimas LYS1 de los hongos filamentosos son bioquímicamente diversas, siendo R. microsporus el que exhibe un cuello de botella catalítico distinto en comparación con los homólogos de Ascomycetes.
2. Restricciones Termodinámicas: La fuerte preferencia por la reacción inversa en todos los homólogos sugiere que el flujo hacia adelante de la biosíntesis de lisina es termodinámicamente desfavorable y probablemente depende de las concentraciones de metabolitos intracelulares y del acoplamiento de la vía para proceder.
3. Origen Mecánico de las Diferencias Cinéticas: La divergencia cinética observada se atribuye no a una pérdida del andamiaje catalítico, sino a diferencias en la organización y estabilidad del complejo ternario. Específicamente, la frecuencia de contactos productivos proteína-ligando y la capacidad de muestrear distancias catalíticas son menores en el enzima de R. microsporus.
4. Implicaciones para la Fermentación: Los datos sugieren que R. microsporus puede tener limitaciones inherentes en su capacidad de producción de lisina en comparación con las especies de Aspergillus o Penicillium. Por consiguiente, estos hallazgos pueden informar la selección de cepas fúngicas para fermentaciones en estado sólido destinadas a mejorar el contenido de lisina en alimentos de origen vegetal. El estudio confirma que la reacción directa es favorecida en condiciones alcalinas, lo que puede implicar requerimientos específicos de localización subcelular (p. ej., peroxisomas) para una función óptima de la vía in vivo.