High-Yield Production and Antigenic Profiling of a Stabilized SARS-CoV-2 S2-Fc Fusion Protein Using GlycoSwitch Pichia pastoris

기술 요약: 안정화된 SARS-CoV-2 S2-Fc 융합 단백질의 고수율 생산 및 항원 프로파일링

문제 제기
SARS-CoV-2 바이러스, 특히 스파이크(S) 단백질의 S1 소단위체 내 수용체 결합 도메인(RBD)에서 발생하는 지속적인 변이는 현재 백신의 장기적 효능을 저해하며 면역 회피를 용이하게 하고 있습니다. S2 소단위체는 변이체 전반에 걸쳐 매우 보존되어 있으며 광범별 면역을 위한 유망한 표적이지만, 백신 항원으로서의 주목은 상대적으로 적었습니다. S2 기반 백신 개발에는 상당한 기술적 난관이 존재합니다. S2 도메인은 응집 및 미스폴딩(misfolding)이 일어나기 쉬운 거대 소수성 영역을 포함하고 있어, 수용성 및 고품질의 재조합 단백질을 생산하는 것이 어렵습니다. 또한, 표준 효모 발현 시스템은 항원 에피토프를 입체적으로 방해하거나 비보호적 면역 반응을 유도할 수 있는 과다 만노스화(hyper-mannosylated) 단백질을 생성하는 경우가 많습니다.

방법론
본 연구는 이러한 과제를 해결하기 위해 글리코 엔지니어링된 Pichia pastoris 시스템을 채택하였습니다.

• 컨스트럭트 설계: SARS-CoV-2 S2 소단위체의 686–1213 잔기를 코돈 최적화하여 인간 IgG1-Fc 도메인에 융합한 유전자를 설계했습니다. Fc 영역에는 FcRn 친화력을 높이고 단백질 분해에 대한 저항성을 강화하기 위한 안정화 돌연변이(T250Q 및 M428L)를 포함했습니다. 18-잔기 Gly-Ser 링커가 S2와 Fc 도메인을 연결했습니다. 용해도를 확보하기 위해 C-말단 관통 영역은 제외되었습니다.
• 발현 시스템: 컨스트럭트는 AOX1 프로모터 하의 pPICZαA 벡터에 삽입되었으며, 야생형 KM71H와 글리코 엔지니어링된 SuperMan5 (SM10) 균주 두 종류의 P. pastoris 균주에 형질전환되었습니다. SM10 균주는 야생형 효모의 전형적인 과다 만노스 구조 대신 인간 유사 핵심 N-글리칸(Man5GlcNAc2)을 생성하는 능력을 갖추도록 선택되었습니다.
• 생산 및 정제: Zeocin 저항성을 통해 고복제수 형질전환체를 선별했습니다. 단백질 발현은 144시간 동안 메탄올을 통해 유도되었습니다. 분비된 단백질은 Protein G-Sepharose 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제되었습니다.
• 특성 분석: 정제된 단백질은 SDS-PAGE, Western blot, 그리고 인간 과면역 혈청을 이용한 Dot blot을 통해 분석되었습니다. 항원성은 열 불활성화된 바이러스 및 참조 백신(RAZI CovoPars)에 대한 이중 직접 및 간접 ELISA를 통해 평가되었습니다. 또한, 유사 바이러스 중화 분석을 통해 기능적 중화 능력을 평가했습니다.

주요 기여

1. 최적화된 S2-Fc 설계: 본 연구는 절단(truncation) 및 Fc 융합을 통해 소수성 응집을 피하면서도 보존된 HR1 및 HR2 도메인을 유지하는 안정화된 S2-Fc 융합 단백질을 성공적으로 설계했습니다.
2. 항원성을 위한 글리코엔지니어링: SM10 균주를 활용함으로써, 글리코실화 프로파일을 과다 만노스화에서 인간 유사 핵심 구조로 전환하는 것이 중화 에피토프의 접근성을 유의미하게 향상시킨다는 것을 입증했습니다.
3. 확장 가능한 생산 플랫폼: 대형 바이러스 글리코단백질과 관련된 발현 병목 현상을 극고하며, S2-Fc 항원을 고수율로 생산할 수 있는 비용 효율적이고 확장 가능한 효모 기반 플랫폼을 구축했습니다.

결과

• 발현 및 수율: SDS-PAGE 결과, N-글리코실화를 포함한 예측 분자량과 일치하는 90–105 kDa 범위에서 글리코실화된 융합 단백질의 발현을 확인했습니다. 최대 축적은 유도 후 72시간에서 120시간 사이에 발생했습니다.
• 정량적 수율: 정제된 수율은 야생형 KM71H 균주에서 18.6 ± 0.72 µg/mL, 글리코 엔지니어링된 SM10 균주에서 20.6 ± 0.85 µg/mL였습니다. SM10 균주의 수율 증가는 통계적으로 유의미했습니다 (p = 0.032).
• 항원 프로파일링: ELISA 결과, SM10 유래 S2-Fc는 KM71H 대응체에 비해 31.4 ± 3.2% 더 높은 결합 친화력을 보였습니다 (p < 0.001). 표준 곡선은 우수한 선형성(R² > 0.98)을 나타냈으며, 결합 반응성은 항체 역가와 강력한 상관관계를 보였습니다 (Pearson's r = 0.994).
• 중화: 유사 바이러스 중화 분석을 통해 재조합 S2-Fc에 의해 유도된 항체가 유사 바이러스 입자를 중화할 수 있음을 확인하였으며, 이는 항원의 기능적 무결성과 적절한 폴딩을 뒷받침합니다.
• 안정성: 정제된 단백질은 144시간의 타임 코스 동안 구조적 및 항원적 안정성을 유지했습니다.

의의
본 논문은 S2 도메인이 유전적 안정성 덕분에 다양한 변이를 중화할 수 있는 광범위한 코로나19 백신 개발을 위한 실행 가능한 후보임을 결론짓습니다. 본 연구는 글리코실화의 양보다 질이 항원성을 결정하는 핵심 요소임을 강조합니다. 저자들은 GlycoSwitch P. pastoris 시스템을 사용하여 적절하게 폴딩되고 글리코실화된 항원 역량을 갖춘 S2-Fc 단백질을 성공적으로 생산했습니다. 이러한 결과는 S2 기반 서브유닛 백신의 추가적인 전임상 평가를 지지하며, 글리코 엔지니어링된 효모 플랫폼이 코로나바이러스 스파이크 유래 단백질 생산을 위한 강력하고 확장 가능한 대안이 될 수 있음을 시사합니다. 저자들은 본 연구가 인 비트로(in vitro) 항원성 및 중화 능력을 확인했으나, 완전한 보호 효능 및 Fc 매개 효과 기능을 결정하기 위해서는 후속 인 비보(in vivo) 연구가 필요하다고 언급했습니다.