High-Yield Production and Antigenic Profiling of a Stabilized SARS-CoV-2 S2-Fc Fusion Protein Using GlycoSwitch Pichia pastoris

Resumen Técnico: Producción de Alto Rendimiento y Perfil Antigénico de una Proteína de Fusión S2-Fc de SARS-CoV-2 Estabilizada

Planteamiento del Problema
La mutación continua del virus SARS-CoV-2, particularmente dentro del dominio de unión al receptor (RBD) de la subunidad S1 de la proteína de la espícula (spike), ha comprometido la eficacia a largo plazo de las vacunas actuales al facilitar la evasión inmunitaria. Dado que la subunidad S2 de la proteína de la espícula está altamente conservada entre las variantes y representa un objetivo prometedor para una inmunidad de amplio espectro, ha recibido menos atención como antígeno de la vacuna. El desarrollo de vacunas basadas en S2 enfrenta obstáculos técnicos significativos: el dominio S2 contiene grandes regiones hidrofóbicas propensas a la agregación y al plegamiento incorrecto, lo que dificulta la producción de una proteína recombinante soluble y de alta calidad. Además, los sistemas de expresión de levadura estándar suelen producir proteínas hipermanosiladas que pueden estorbar estéricamente los epítopos antigénicos o inducir respuestas inmunitarias no protectoras.

Metodología
El estudio empleó un sistema de Pichia pastoris con ingeniería de glicosilación para abordar estos desafíos.

• Diseño del Constructo: Se diseñó un gen codificado mediante optimización de codones que codifica los residuos 686–1213 de la subunidad S2 de SARS-CoV-2, fusionado a un dominio Fc de la IgG1 humana. La región Fc incluyó mutaciones estabilizadoras (T250Q y M428L) para mejorar la afinidad por el FcRn y la resistencia a la proteólisis. Un conector (linker) de Gly-Ser de 18 residuos conectó los domios S2 y Fc. Se excluyó la región transmembrana C-terminal para asegurar la solubilidad.
• Sistema de Expresión: El constructo se insertó en el vector pPICZαA bajo el promotor AOX1 y se transformó en dos cepas de P. pastoris: la de tipo silvestre KM71H y la cepa de ingeniería de glicosilación SuperMan5 (SM10). La cepa SM10 fue seleccionada por su capacidad para producir N-glicanos de núcleo similares a los humanos (Man5GlcNAc2) en lugar de las estructuras hipermanosiladas típicas de la levadura silvestre.
• Producción y Purificación: Se seleccionaron transformantes de alto número de copias mediante resistencia a la zeocina. La expresión de la proteína se indujo con metanol durante 144 horas. Las proteínas secretadas se purificaron mediante cromatografía de afinidad con Protein G-Sepharose.
• Caracterización: Las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE, Western blot y Dot blot utilizando sueros humanos hiperinmunes. La antigenicidad se evaluó mediante ensayos ELISA de doble directo e indirecto contra el virus inactivado por calor y una vacuna de referencia (RAZI CovoPars). La neutralización funcional se evaluó mediante ensayos de neutralización de pseudovirus.

Contribuciones Clave

1. Diseño Optimizado de S2-Fc: El estudio logró diseñar con éxito una proteína de fusión S2-Fc estabilizada que conserva los dominios HR1 y HR2 mientras evita la agregación hidrofóbica mediante truncamiento y fusión con Fc.
2. Ingeniería de Glicosilación para la Antigenicidad: Al utilizar la cepa SM10, los investigadores demostraron que el cambio del perfil de glicosilación de la hipermanosilación hacia estructuras de núcleo similares a las humanas mejora significamente la accesibilidad de los epítopos neutralizantes.
3. Plataforma de Producción Escalable: El estudio estableció una plataforma basada en levadura, rentable y escalable, para la producción de altos rendimientos del antígeno S2-Fc, superando los cuellos de botella de expresión asociados con las glicoproteínas virales de gran tamaño.

Resultados

• Expresión y Rendimiento: El SDS-PAGE confirmó la expresión de una proteína de fusión glicosilada en el rango de 90–105 kDa, consistente con el peso molecular predicho incluyendo la N-glicosilación. La acumulación máxima ocurrió entre las 72 y 120 horas post-inducción.
• Rendimiento Cuantitativo: Los rendimientos purificados fueron de 18.6 ± 0.72 µg/mL para la cepa silvestre KM71H y de 20.6 ± 0.85 µg/mL para la cepa de ingeniería SM10. El aumento en el rendimiento para la cepa SM10 fue estadísticamente significativo (p = 0.032).
• Perfil Antigénico: Los resultados de ELISA mostraron que la S2-Fc derivada de SM10 exhibió una afinidad de unión un 31.4 ± 3.2% mayor en comparación con su contraparte KM71H (p < 0.001). Las curvas estándar demostraron una excelente linealidad (R² > 0.98), y la reactividad de unión se correlacionó fuertemente con los títulos de anticuerpos (r de Pearson = 0.994).
• Neutralización: Los ensayos de neutralización de pseudovirus confirmaron que los anticuerpos eliciados contra la S2-Fc recombinante podían neutralizar partículas virales pseudotipadas, lo que respalda la integridad funcional y el plegamiento adecuado del antígeno.
• Estabilidad: La proteína purificada mantuvo la estabilidad estructural y antigénica durante un curso de tiempo de 144 horas.

Significancia
El artículo concluye que el dominio S2 es un candidato viable para el desarrollo de vacunas de COVID-19 de amplio espectro capaces de neutralizar diversas variantes debido a su estabilidad genética. El estudio destaca que la calidad de la glicosilación, más que solo la cantidad, es un determinante crítico de la antigenicidad. Al utilizar el sistema P. pastoris GlycoSwitch, los autores produjeron con éxito una proteína S2-Fc correctamente plegada, glicosilada y con capacidad antigénica. Estos hallazgos respaldan la evaluación preclínica adicional de las vacunas de subunidades basadas en S2 y sugieren que las plataformas de levadura con ingeniería de glicosilación ofrecen una alternativa robusta y escalable a los sistemas de mamíferos para la producción de proteínas derivadas de la espícula de coronavirus. Los autores señalan que, si bien el estudio confirma la antigenicidad y la neutralización in vitro, se requieren estudios in vivo posteriores para determinar la eficacia protectora completa y las funciones efectoras mediadas por Fc.