High-Yield Production and Antigenic Profiling of a Stabilized SARS-CoV-2 S2-Fc Fusion Protein Using GlycoSwitch Pichia pastoris

Resumo Técnico: Produção de Alto Rendimento e Perfil Antigênico de uma Proteína de Fusão S2-Fc de SARS-CoV-2 Estabilizada

Problema
A mutação contínua do vírus SARS-CoV-2, particularmente dentro do domínio de ligação ao receptor (RBD) da subunidade S1 da proteína spike (S), comprometeu a eficácia de longo prazo das vacinas atuais ao facilitar o escape imunológico. A subunidade S2 da proteína spike é altamente conservada entre as variantes e representa um alvo promissor para imunidade de amplo espectro, mas recebeu menos atenção como antígeno vacinal. O desenvolvimento de vacinas baseadas em S2 enfrenta obstáculos técnicos significativos: o domínio S2 contém grandes regiões hidrofóbicas propensas à agregação e ao erro de enovelamento (misfolding), tornando difícil a produção de proteína recombinante solúvel e de alta qualidade. Além disso, sistemas de expressão padrão em levedura frequentemente produzem proteínas hipermanosiladas que podem dificultar estericamente os epítopos antigênicos ou induzir respostas imunes não protetivas.

Metodologia
O estudo empregou um sistema de Pichia pastoris com engenharia glicosilação para abordar esses desafios.

• Design do Constructo: Um gene codificado por códons otimizados para os resíduos 686–1213 da subunidade S2 do SARS-CoV-2 foi fundido a um domínio Fc de IgG1 humana. A região Fc incluiu mutações estabilizadoras (T250Q e M428L) para aumentar a afinidade com o FcRn e a resistência à proteólise. Um linker Gly-Ser de 18 resíduos conectou os domínios S2 e Fc. A região transmembrana C-terminal foi excluída para garantir a solubilidade.
• Sistema de Expressão: O constructo foi inserido no vetor pPICZαA sob o promotor AOX1 e transformado em duas linhagens de P. pastoris: a linhagem selvagem KM71H e a linhagem engenheirada para glicosilação SuperMan5 (SM10). A linhagem SM10 foi selecionada por sua capacidade de produzir N-glicanos de núcleo semelhantes aos humanos (Man5GlcNAc2), em vez das estruturas hipermanosiladas típicas da levedura selvagem.
• Produção e Purificação: Transformantes de alta cópia foram selecionados via resistência à zeocina. A expressão proteica foi induzida com metanol ao longo de 144 horas. As proteínas secretadas foram purificadas via cromatografia de afinidade por Protein G-Sepharose.
• Caracterização: As proteínas purificadas foram analisadas via SDS-PAGE, Western blot e Dot blot utilizando soros hiperimunes humanos. A antigenicidade foi avaliada através de ELISAs de dupla direção direta e indireta contra o vírus inativado por calor e uma vacina de referência (RAZI CovoPars). A neutralização funcional foi avaliada usando ensaios de neutralização de pseudovírus.

Principais Contribuições

1. Design Otimizado de S2-Fc: O estudo conseguiu projetar uma proteína de fusão S2-Fc estabilizada que retém os domínios HR1 e HR2 conservados, evitando a agregação hidrofóbica através de truncamento e fusão com Fc.
2. Engenharia de Glicosilação para Antigenicidade: Ao utilizar a linhagem SM10, os pesquisadores demonstraram que a mudança no perfil de glicosilação da hipermanosilação para estruturas de núcleo semelhantes às humanas aumenta significamente a acessibilidade dos epítopos neutralizantes.
3. Plataforma de Produção Escalável: O estudo estabeleceu uma plataforma de expressão em levedura custo-efetiva e escalável para a produção de altos rendimentos do antígeno S2-Fc, superando gargalos de expressão associados a grandes glicoproteínas virais.

Resultos

• Expressão e Rendimento: O SDS-PAGE confirmou a expressão de uma proteína de fusão glicosilada na faixa de 90–105 kDa, consistente com o peso molecular previsto incluindo a N-glicosilação. O acúmulo máximo ocorreu entre 72 e 120 horas após a indução.
• Rendimento Quantitativo: Os rendimentos purificados foram de 18,6 ± 0,72 µg/mL para a linhagem selvagem KM71H e 20,6 ± 0,85 µg/mL para a linhagem engenheirada SM10. O aumento no rendimento para a linhagem SM10 foi estatisticamente significativo (p = 0,032).
• Perfil Antigenico: Os resultados de ELISA mostraram que o S2-Fc derivado de SM10 exibiu uma afinidade de ligação 31,4 ± 3,2% maior em comparação com o correspondente KM71H (p < 0,001). As curvas padrão demonstraram excelente linearidade (R² > 0,98), e a reatividade de ligação correlacionou-se fortemente com os títulos de anticorpos (Pearson's r = 0,994).
• Neutralização: Ensaios de neutralização de pseudovírus confirmaram que os anticorpos elicitados contra o S2-Fc recombinante puderam neutralizar partículas virais pseudotipadas, apoiando a integridade funcional e o enovelamento adequado do antígeno.
• Estabilidade: A proteína purificada manteve a estabilidade estrutural e antigênica ao longo de um curso de 144 horas.

Significância
O artigo conclui que o domínio S2 é um candidato viável para o desenvolvimento de vacinas de amplo espectro contra a COVID-19, capazes de neutralizar diversas variantes devido à sua estabilidade genética. O estudo destaca que a qualidade da glicosilação, e não apenas a quantidade, é um determinante crítico da antigenicidade. Ao utilizar o sistema P. pastoris GlycoSwitch, os autores produziram com sucesso uma proteína S2-Fc adequadamente enovelada, glicosilada e antigenicamente competente. Esses achados apoiam a avaliação pré-clínica adicional de vacinas de subunidade baseadas em S2 e sugerem que plataformas de levedura com engenharia de glicosilação oferecem uma alternativa robusta e escalável aos sistemas de mamíferos para a produção de proteínas derivadas da spike de coronavírus. Os autores observam que, embora o estudo confirme a antigenicidade e a neutralização in vitro, estudos in vivo subsequentes são necessários para determinar a eficácia protetora total e as funções efetoras mediadas por Fc.