In vitro and in vivo Immunotherapy effect of Rosmarinus officinalis and Hygrophila spinosa cultivated from Nilgiri hills origin, India: A Comparative Study of Pharmacognostical, Toxicological, Phytochemical and Preclinical Analysis

기술 요약: Rosmarinus officinalis와 Hygrophila spinosa의 비교 면역 조절 및 독성학적 분석

문제 제기
Rosmarinus officinalis(로즈마리)와 Hygrophila spinosa는 염증 및 면역 관련 질환 치료를 위해 전통 의학 체계에서 널리 활용되고 있으나, 특히 인도 닐기리 힐스(Nilgiri Hills) 지역에서 채취된 표본에 대한 구체적인 면역 조절 잠재력, 안전성 프로필 및 약용 식물학적 표준화에 관한 포괄적인 데이터는 부족한 실정이다. 기존의 면역 조절 약물은 간독성 및 돌연변이 유발을 포함한 심각한 장기 부작용의 위험을 수반하는 경우가 많다. 따라서 면역 기능을 조절하면서도 독성을 유발하지 않는 자연적이고 안전하며 효과적인 식물 기반 대안을 식별해야 할 결정적인 필요성이 존재한다. 본 연구는 두 식물의 수성 에탄올 추출물에 대한 약용 식물학적, 파이토케미컬(phytochemical), 항산화, 세포 독성, 독성학적 및 면역 조절 특성의 비교 분석을 제공함으로써 문헌상의 공백을 메우고자 한다.

연구 방법
본 연구는 약용 식물학적, 파이토케미컬 및 전임상 평가를 포함하는 다각적인 접근 방식을 채택하였다:

• 시료 준비: 닐기리 힐스에서 채집하여 인증된 R. officinalis와 H. spinosa의 신선한 잎과 지상부를 75% 수성 에탄올을 이용한 열 침출법(hot percolation)으로 추출하고 그늘에서 건조하였다.
• 약용 식물학적 및 파이토케미컬 분석: 물리화학적 파라미터(회분 값, 수분 함량, 추출물 값)를 결정하였다. 예비 파이토케미컬 스크리닝을 통해 주요 이차 대사산물을 확인하였다. 품질 평가를 위해 고성능 박층 크로마토그래피(HPTLC)를 사용하여 파이토케미컬 지문(fingerprint)을 생성하였다.
• 항산화 활성: DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 자유 라디칼 소거 능력을 통해 평가하였으며, 결과는 IC₅₀ 값으로 표시하였다.
• 세포 독성: 인간 결장암 세포주(HT-29 및 Caco-2)를 대상으로 25 ~ 400 µg/mL 농도 범위에서 MTT 분석을 통해 평가하였다.
• 급성 경구 독성: OECD 가이드라인 423에 따라 쥐를 대상으로 실시하였다. 최대 2000 mg/kg 용량 투여 후 최대 60분까지 기능적 관찰 배터리(FOB) 파라미터를 모니터링하였다.
• In Vitro 면역 조절:
  • 비만 세포 안정화: 복강 비만 세포로부터 히스타민 방출 억제 정도를 측정하였다.
  • 식균 활성: Candida albicans에 대한 인간 다형핵 백혈구(PMN)의 식균 지수를 평가하였다.
• In Vivo 면 имму 조절: 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)로 면역이 억제된 마우스를 대상으로 수행하였다. 파라미터는 다음과 같다:
  • 지연형 과민 반응(DTH)
  • 응집소(HA) 항체 역가
  • 혈액학적 파라미터(WBC, RBC, 헤모글로빈, 중성구 부착)
  • 사이토카인 프로파일링(IgG, IgM, IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ, TGF-β)

주요 기여

1. 표준화: 닐기리 힐스에서 채집된 R. officinalis와 H. spinosa에 대한 약용 식물학적 표준 및 HPTLC 지문을 확립하여 품질 관리를 위한 기준을 제공하였다.
2. 안전성 프로필: 두 추출물 모두 2000 mg/kg까지 무독성(LD₅₀ > 2000 mg/kg)임을 입증하였으며, 치료 농도에서 인간 장 세포에 대해 세포 독성을 나타내지 않았으며 세포 생존율이 90% 이상으로 유지되었다.
3. 비교 면역 조절: 두 식물 모두 면역 조절 특성을 보유하고 있으나, 특히 사이클로포스파미드에 의해 저하된 면역 기능을 회복시키는 데 있어 R. officinalis가 특정 in vivo 모델에서 우수한 효능을 보임을 직접 비교 제시하였다.
4. 기전적 통찰: 이들 추출물의 항산화 및 면역 자극제로서의 이중 작용을 규명하였으며, 파이토케미컬 성분(페놀류, 플라보노이드, 테르페노이드)과 생물학적 활성 사이의 연관성을 밝혀냈다.

주요 결과

• 파이토케미컬: 두 추출물 모두 페놀류, 플라보노이드, 알칼로이드, 사포닌 및 테르페노이드가 풍려하였다. H. spinosa는 탄수화물과 스테롤을 독특하게 포함하고 있었으며, R. officinalis는 에탄올과 물 모두에서 더 높은 추출물 값을 보였다. HPTPI는 두 종의 구별되고 복잡한 화학적 지문을 확인하였다.
• 항산화 활성: 두 추출물 모두 중간 정도의 자유 라디칼 소거 활성을 나타냈다. H. spinosa는 R. officinalis(231.5 ± 11.6 µg/mL)보다 약간 낮은 IC₅₀(229.5 ± 9.2 µg/mL)를 보였으나, 두 추출물 모두 표준 물질인 Trolox(5.36 µg/mL)보다는 효력이 낮았다.
• 세포 독성: 400 µg/mL 농도까지 HT-29 또는 Caco-2 세포에 대해 세포 독성 효과가 관찰되지 않았으며, 세포 생존율은 90%를 초과하였다.
• 급성 독성: 쥐에게 2000 mg/kg 용량까지 투여했을 때 사망이나 행동/신경학적 이상이 관찰되지 않았다.
• In Vitro 면역 조절: 두 추출물 모두 비만 세포 탈과립을 억제하고 식균 작용을 강화하였다. R. officinalis는 400 µg/mL에서 79.48%의 비만 세포 안정화를 보여 H. spinosa(73.33%)보다 약간 높은 성능을 나타냈다.
• In Vivo 면역 조절 (사이클로포스파미드 모델):
  • R. officinalis는 사이클로포스파미드 유도 면역 억제를 용량 의존적 방식(250 및 500 mg/kg)으로 유의하게 역전시켰다.
  • 체액성 면역: 응집소 항체 역가, IgG 및 IgM 수치를 회복시켰다.
  • 세포성 면역: DTH 반응 및 중성구 부착을 개선하였다.
  • 사이토카인 조절: IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10의 수치를 정상화하였고, 면역 억제와 관련된 상승된 TGF-β 수치를 감소시켰다.
  • 혈액학: 사이클로포스파미드에 의한 WBC, RBC 및 헤모글로빈의 감소를 역전시켰다.
  • H. spinosa는 본 연구의 in vivo 사이클로포스파미드 모델에서는 테스트되지 않았다. 즉, in vivo 비교 데이터는 R. officinalis에 집중되어 있다.

의의 및 주장
저자들은 Rosmarinus officinalis와 Hygrophila spinosa가 모두 안전하고 독성이 없으며 유의미한 항산화 및 면역 조절 특성을 가지고 있음을 결론지어, 이들의 전통적 사용을 입증하였다. 그러나 본 연구는 특히 R. officinalis가 면역 억제 상태에서 면역 파라미터를 회복시키는 데 있어 우수한 면역 자극 잠재력을 가지고 있음을 강조한다. 논문은 R. officinalis가 천연 면역 요법의 유망한 후보이며 식물 기반 면역 조절제의 개발을 위한 리드(lead) 역할을 할 수 있다고 주장한다. 저자들은 관찰된 효과가 페놀류, 플라보노이드, 테르페노이드와 같은 이차 대사산물의 시너지 작용에 기인한 것으로 보고 있다. 또한 현재의 결과가 유망하지만, 생물 활성 화합물의 분리, 분자 기전 규명, 약동학 및 멀티오믹스 연구를 포함한 추가 연구가 치료적 잠재력을 완전히 확인하기 위해 필요하다고 언급하였다.