In vitro and in vivo Immunotherapy effect of Rosmarinus officinalis and Hygrophila spinosa cultivated from Nilgiri hills origin, India: A Comparative Study of Pharmacognostical, Toxicological, Phytochemical and Preclinical Analysis

Technische Samenvatting: Vergelijkende Immunomodulerende en Toxicologische Analyse van Rosmarinus officinalis en Hygrophila spinosa

Probleemstelling
Hoewel Rosmarinus officinalis (rozemarijn) en Hygrophila spinosa breed worden toegepast in traditionele medische systemen voor de behandeling van ontstekingsziekten en immuurgerelateerde stoornissen, is er een gebrek aan uitgebreide gegevens over hun specifieke immunomodulerende potentieel, veiligheidsprofielen en farmacognostische standaardisatie, in het bijzonder wanneer deze afkomstig zijn uit de Nilgiri Hills-regio in India. Conventionele immunomodulerende geneesmiddelen brengen vaak risico's met zich mee van ernstige langetermijnbijwerkingen, waaronder hepatotoxiciteit en mutagenese. Bijgevolg is er een kritieke behoefte aan het identificeren van natuurlijke, veilige en effectieve plantaardige alternatieven die de immuunfunctie kunnen moduleren zonder toxiciteit te induceren. Deze studie adresseert de leemte in de literatuur door een vergelijkende analyse te bieden van de farmacognostische, fytochemische, antioxidante, cytotoxische, toxicologische en immunomodulerende eigenschappen van de waterige ethanolextracten van deze twee planten.

Methodologie
De studie maakte gebruik van een veelzijdige aanpak bestaande uit farmacognostische, fytochemische en preklinische evaluaties:

• Monsterpreparatie: Verse bladeren en bovengrondse delen van R. officinalis en H. spinosa werden verzameld in de Nilgiri Hills, geauthenticeerd, in de schaduw gedroogd en geëxtraheerd middels hete percolatie met 75% waterige ethanol.
• Farmacognostische & Fytochemische Analyse: Fysisch-chemische parameters (aswaarden, vochtgehalte, extractiewaarden) werden bepaald. Voorlopige fytochemische screening identificeerde belangrijke secundaire metabolieten. High-Performance Thin-Layer Chromatography (HPTLC) werd gebruikt om fytochemische vingerafdrukken te genereren voor kwaliteitsbeoordeling.
• Antioxidant Activiteit: Geëvalueerd via de DPPH (1,1-difenyl-2-picrylhydrazyl) vrije radicalen wegvangsassay, waarbij resultaten worden uitgedrukt in IC₅₀-waarden.
• Cytotoxiciteit: Beoordeeld met de MTT-assay op humane coloncarcinoom cellijnen (HT-29 en Caco-2) bij concentraties variërend van 25 tot 400 µg/mL.
• Acute Orale Toxiciteit: Uitgevoerd bij ratten volgens de OECD Richtlijn 423. Parameters van de Functional Observational Battery (FOB) werden gemonitord op intervallen tot 60 minuten na toediening van doses tot 2000 mg/kg.
• In Vitro Immunomodulatie:
  • Mastcelstabilisatie: Gemeten door de inhibitie van histaminevrijgave uit peritoneale mastcellen.
  • Fagocytische Activiteit: Beoordeeld door de fagocytische index van humane polymorfkernige leukocyten (PMN's) tegen Candida albicans.
• In Vivo Immunomodulatie: Uitgevoerd op muizen die immuunonderdrukkend waren gemaakt door cyclofosfamide. Parameters omvatten:
  • Delayed-Type Hypersensitivity (DTH) respons.
  • Hemagglutinatie (HA) antilichaamtiters.
  • Hematologische parameters (WBC, RBC, Hemoglobine, Neutrofiel adhesie).
  • Cytokineprofilering (IgG, IgM, IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ, TGF-β).

Belangrijkste Bijdragen

1. Standaardisatie: Vaststelling van farmacognostische standaarden en HPTLC-vingerafdrukken voor R. officinalis en H. spinosa verzameld in de Nilgiri Hills, wat een basis biedt voor kwaliteitscontrole.
2. Veiligheidsprofiel: Aangetoond dat beide extracten niet-toxisch zijn tot 2000 mg/kg (LD₅₀ > 2000 mg/kg) en geen cytotoxiciteit vertonen tegen humane darmcellijnen bij therapeutische concentraties, waarbij de celviabiliteit boven de 90% blijft.
3. Vergelijkende Immunomodulatie: Biedt een directe vergelijking die aantoont dat hoewel beide planten immunomodulerende eigenschappen bezitten, R. officinalis een superieure effectiviteit vertoigt in specifieke in vivo modellen, met name bij het herstellen van de immuunfunctie die door cyclofosfamide is aangetast.
4. Mechanistisch Inzicht: Verduidelijking van de dubbele werking van deze extracten als zowel antioxidanten als immuunstimulatoren, waarbij de link wordt gelegd tussen de fytochemische inhoud (fenolen, flavonoïden, terpenoïden) en biologische activiteit.

Belangrijkste Resultaten

• Fytochemie: Beide extracten waren rijk aan fenolen, flavonoïden, alkaloïden, saponinen en terpenoïden. H. spinosa bevatte uniek koolhydraten en sterolen, terwijl R. officinalis hogere extractiewaarden vertoonde in zowel ethanol als water. HPTLC bevestigde onderscheidende en complexe chemische vingerafdrukken voor beide soorten.
• Antioxidant Activiteit: Beide extracten vertoonden matige vrije radicalen wegvangsactiviteit. H. spinosa vertoonde een iets lagere IC₅₀ (229,5 ± 9,2 µg/mL) vergeleken met R. officinalis (231,5 ± 11,6 µg/mL), hoewel beide minder potent waren dan de standaard Trolox (5,36 µg/mL).
• Cytotoxiciteit: Geen cytotoxische effecten werden waargenomen op HT-29 of Caco-2 cellen bij concentraties tot 400 µg/mL, waarbij de celviabiliteit boven de 90% bleef.
• Acute Toxiciteit: Geen mortaliteit of gedrags-/neurologische abnormaliteiten waargenomen bij ratten bij doses tot 2000 mg/kg.
• In Vitro Immunomodulatie: Beide extracten inhibeerden mastceldegranulatie en verhoogden fagocytose. R. officinalis vertoonde een iets hogere mastcelstabilisatie (79,48% bij 400 µg/mL) vergeleken met H. spinosa (73,33%).
• In Vivo Immunomodulatie (Cyclofosfamide Model):
  • R. officinalis herstelde de door cyclofosfamide geïnduceerde immuunonderdrukking op een dosisafhankelijke wijze (250 en 500 mg/kg).
  • Humorale Immuniteit: Herstelde hemagglutinatie antilichaamtiters, IgG- en IgM-niveaus.
  • Cellulaire Immuniteit: Verbeterde de DTH-respons en neutrofiel adhesie.
  • Cytokine Modulatie: Normaliseerde de niveaus van IFN-γ, IL-2, IL-4 en IL-10, en verminderde de verhoogde TGF-β niveaus geassocieerd met immuunonderdrukking.
  • Hematologie: Keerde de daling in WBC, RBC en hemoglobine veroorzaakt door cyclofosfamide om.
  • H. spinosa werd in deze studie niet getest in het in vivo cyclofosfamide model; de in vivo vergelijkende data richten zich specifiek op R. officinalis.

Significantie en Claims
De auteurs concluderen dat zowel Rosmarinus officinalis als Hygrophila spinosa veilig en niet-toxisch zijn en significante antioxidant en immunomodulerende eigenschappen bezitten, wat hun traditionele gebruik valideert. De studie benadrukt echter specifiek R. officinalis als een superieur kandidaat voor immunostimulerend potentieel, met name bij het herstellen van immuunparameters in immuunonderdrukte staten. Het artikel stelt dat R. officinalis een veelbelovende kandidaat is voor natuurlijke immunotherapie en kan dienen als een 'lead' voor de ontwikkeling van plantaardige immunomodulerende middelen. De auteurs suggereren dat de waargenomen effecten waarschijnlijk te wijten zijn aan de synergetische werking van secundaire metabolieten zoals fenolen, flavonoïden en terpenoïden. Zij merken op dat hoewel de huidige resultaten veelbelovend zijn, verder onderzoek naar isolatie van bioactieve verbindingen, elucidatie van moleculaire mechanismen, farmacokinetiek en multi-omics studies vereist is om het therapeutische potentieel volledig te bevestigen.