In vitro and in vivo Immunotherapy effect of Rosmarinus officinalis and Hygrophila spinosa cultivated from Nilgiri hills origin, India: A Comparative Study of Pharmacognostical, Toxicological, Phytochemical and Preclinical Analysis

Resumo Técnico: Análise Comparativa Imunomoduladora e Toxicológica de Rosmarinus officinalis e Hygrophila spinosa

Definição do Problema
Embora o Rosmarinus officinalis (alecrim) e a Hygrophila spinosa sejam amplamente utilizados em sistemas médicos tradicionais para o tratamento de distúrbios inflamatórios e imunológicos, há uma escassez de dados abrangentes sobre o seu potencial imunomodulador específico, perfis de segurança e padronização farmacognóstica, particularmente quando provenientes da região das Colinas de Nilgiri, na Índia. Os fármacos imunomoduladores convencionais frequentemente carregam riscos de efeitos colaterais graves a longo prazo, incluindo hepatotoxicidade e mutagenicidade. Consequentemente, há uma necessidade crítica de identificar alternativas naturais, seguras e eficazes baseadas em plantas que possam modular a função imune sem induzir toxicidade. Este estudo aborda a lacuna na literatura ao fornecer uma análise comparativa das propriedades farmacognósticas, fitoquímicas, antioxidantes, citotóxicas, toxicológicas e imunomoduladoras de extratos etanólicos aquosos destas duas plantas.

Metodologia
O estudo empregou uma abordagem multifacetada envolvendo avaliações farmacognósticas, fitoquímicas e pré-clínicas:

• Preparação da Amostra: Folhas frescas e partes aéreas de R. officinalis e H. spinosa foram coletadas nas Colinas de Nilgiri, autenticadas, secas à sombra e extraídas por percolação a quente com etanol aquoso a 75%.
• Análise Farmacognóstica e Fitoquímica: Parâmetros físico-químicos (valores de cinzas, teor de umidade, valores de extrativos) foram determinados. A triagem fitoquímica preliminar identificou os principais metabólitos secundários. A Cromatografia em Camada Delgada de Alta Performance (HPTLC) foi utilizada para gerar impressões digitais fitoquímicas para avaliação de qualidade.
• Atividade Antioxidante: Avaliada via ensaio de sequestro de radicais livres DPPH (1,1-difenil-2-picrilhydrazyl), com resultados expressos em valores de IC₅₀.
• Citotoxicidade: Avaliada através do ensaio MTT em linhagens celulares de carcinoma de cólon humano (HT-29 e Caco-2) em concentrações variando de 25 a 400 µg/mL.
• Toxicidade Oral Aguda: Realizada em ratos seguindo a Diretriz OECD 423. Parâmetros da Bateria de Observação Funcional (FOB) foram monitorados em intervalos de até 60 minutos após a administração de doses de até 2000 mg/kg.
• Imunomodulação In Vitro:
  • Estabilização de Mastócitos: Medida pela inibição da liberação de histamina de mastócitos peritoneais.
  • Atividade Fagocítica: Avaliada pelo índice de fagocitose de leucócitos polimorfonucleares (PMNs) humanos contra Candida albicans.
• Imunomodulação In Vivo: Realizada em camundongos imunossuprimidos por ciclofosfamida. Os parâmetros incluíram:
  • Resposta de Hipersensibilidade do Tipo Retardado (DTH).
  • Títulos de anticorpos de Hemaglutinação (HA).
  • Parâmetros hematológicos (WBC, RBC, Hemoglobina, adesão de Neutrófilos).
  • Perfil de citocinas (IgG, IgM, IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ, TGF-β).

Principais Contribuições

1. Padronização: Estabeleceu padrões farmacognósticos e impressões digitais de HPTLC para R. officinalis e H. spinosa coletadas nas Colinas de Nilgiri, fornecendo uma base para o controle de qualidade.
2. Perfil de Segurança: Demonstrou que ambos os extratos não são tóxicos até 2000 mg/kg (LD₅₀ > 2000 mg/kg) e não exibem citotoxicidade contra linhagens celulares intestinais humanas em concentrações terapêuticas, com a viabilidade celular permanecendo acima de 90%.
3. Imunomodulação Comparativa: Forneceu uma comparação direta mostrando que, embora ambas as plantas possuam propriedades imunomoduladoras, o R. officinalis exibe eficácia superior em modelos in vivo específicos, particularmente na restauração da função imune comprometida por ciclofosfamida.
4. Insight Mecanístico: Elucidou a ação dual destes extratos como antioxidantes e estimuladores imunes, ligando o conteúdo fitoquímico (fenólicos, flavonoides, terpenoides) à atividade biológica.

Principais Resultados

• Fitoquímica: Ambos os extratos foram ricos em fenólicos, flavonoides, alcaloides, saponinas e terpenoides. A H. spinosa continha exclusivamente carboidratos e esteróis, enquanto o R. officinalis apresentou maiores valores de extrativos tanto em etanol quanto em água. A HPTLC confirmou impressões digitais químicas distintas e complexas para ambas as espécies.
• Atividade Antioxidante: Ambos os extratos demonstraram atividade moderada de sequestro de radicais livres. A H. spinosa apresentou um IC₅₀ ligeiramente inferior (229,5 ± 9,2 µg/mL) em comparação ao R. officinalis (231,5 ± 11,6 µg/mL), embora ambos tenham sido menos potentes que o padrão Trolox (5,36 µg/mL).
• Citotoxicidade: Nenhum efeito citotóxico foi observado nas células HT-29 ou Caco-2 em concentrações de até 400 µg/mL, com a viabilidade celular excedendo 90%.
• Toxicidade Aguda: Não foram observadas mortalidade ou anormalidades comportamentais/neurológicas em ratos em doses de até 2000 mg/kg.
• Imunomodulação In Vitro: Ambos os extratos inibiram a desgranulação de mastócitos e aumentaram a fagocitose. O R. officinalis demonstrou uma estabilização de mastócitos ligeiramente superior (79,48% a 400 µg/mL) em comparação à H. spinosa (73,33%).
• Imunomodulação In Vivo (Modelo de Ciclofosfamida):
  • O R. officinalis reverteu significativamente a imunossupressão induzida por ciclofosfamida de forma dependente da dose (250 e 500 mg/kg).
  • Imunidade Humoral: Restaurou os títulos de anticorpos de hemaglutinação, níveis de IgG e IgM.
  • Imunidade Celular: Melhorou a resposta DTH e a adesão de neutrófilos.
  • Modulação de Citocinas: Normalizou os níveis de IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10, e reduziu os níveis elevados de TGF-β associados à imunossupressão.
  • Hematologia: Reverteu o declínio em WBC, RBC e hemoglobina causado pela ciclofosfamida.
  • A H. spinosa não foi testada no modelo in vivo de ciclofosfamida neste estudo; os dados comparativos in vivo focam no R. officinalis.

Significância e Alegações
Os autores concluem que tanto o Rosmarinus officinalis quanto a Hygrophila spinosa são seguros, não tóxicos e possuem propriedades antioxidantes e imunomoduladoras significativas, validando o seu uso tradicional. No entanto, o estudo destaca especificamente o R. officinalis como tendo um potencial imunestimulante superior, particularmente na restauração de parâmetros imunes em estados de imunossupressão. O artigo postula que o R. officinalis é um candidato promissor para a imunoterapia natural e pode servir como um guia para o desenvolvimento de agentes imunomoduladores baseados em plantas. Os autores sugerem que os efeitos observados são provavelmente devidos à ação sinérgica de metabólitos secundários, tais como fenólicos, flavonoides e terpenoides. Eles observam que, embora os resultados atuais sejam promissores, investigações adicionais envolvendo o isolamento de compostos bioativos, elucidação de mecanismos moleculares, farmacocinética e estudos de multi-ômica são necessários para confirmar plenamente o potencial terapêutico.