In vitro and in vivo Immunotherapy effect of Rosmarinus officinalis and Hygrophila spinosa cultivated from Nilgiri hills origin, India: A Comparative Study of Pharmacognostical, Toxicological, Phytochemical and Preclinical Analysis

Resumen Técnico: Análisis Comparativo Inmunomodulador y Toxicológico de Rosmarinus officinalis y Hygrophila spinosa

Planteamiento del Problema
Si bien Rosmarinus officinalis (romero) e Hygrophila spinosa son ampliamente utilizados en sistemas médicos tradicionales para tratar trastornos inflamatorios e inmunológicos, existe una escasez de datos exhaustivos sobre su potencial inmunomodulador específico, perfiles de seguridad y estandarización farmacognóstica, particularmente cuando se obtienen de la región de las colinas de Nilgiri en la India. Los fármacos inmunomoduladores convencionales suelen conllevar riesgos de efectos secundarios graves a largo plazo, incluyendo la hepatotoxicidad y la mutagénesis. En consecuencia, existe una necesidad crítica de identificar alternativas naturales, seguras y eficaces basadas en plantas que puedan modular la función inmunitaria sin inducir toxicidad. Este estudio aborda la brecha en la literatura proporcionando un análisis comparativo de las propiedades farmacognósticas, fitoquímicas, antioxidantes, citotóxicas, toxicológicas e inmunomoduladoras de los extractos acuosos etanólicos de estas dos plantas.

Metodología
El estudio empleó un enfoque multifacético que involucró evaluaciones farmacognósticas, fitoquímicas y preclínicas:

• Preparación de la Muestra: Se recolectaron hojas frescas y partes aéreas de R. officinalis y H. spinosa de las colinas de Nilgiri, las cuales fueron autenticadas, secadas a la sombra y extraídas mediante percolación en caliente con etanol acuoso al 75%.
• Análisis Farmacognóstico y Fitoquímico: Se determinaron los parámetros fisicoquímicos (valores de cenizas, contenido de humedad, valores de extracto) y se realizó un cribado fitoquímico preliminar para identificar los principales metabolitos secundarios. Se utilizó Cromatografía de Capa Fina de Alto Rendimiento (HPTLC) para generar huellas dactilares fitoquímicas para la evaluación de la calidad.
• Actividad Antioxidante: Evaluada mediante el ensayo de eliminación de radicales libres DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazilo), con resultados expresados en valores de IC₅₀.
• Citotoxicidad: Evaluada mediante el ensayo MTT en líneas celulares de carcinoma de colon humano (HT-29 y Caco-2) en concentraciones que oscilaron entre 25 y 400 µg/mL.
• Toxicidad Oral Aguda: Realizada en ratas siguiendo la Guía OECD 423. Se monitorearon los parámetros de la Batería de Observación Funcional (FOB) en intervalos de hasta 60 minutos tras la administración de dosis de hasta 2000 mg/kg.
• Inmunomodulación In Vitro:
  • Estabilización de Mastocitos: Medida mediante la inhibición de la liberación de histamina de los mastocitos peritoneales.
  • Actividad Fagocítica: Evaluada mediante el índice de fagocitosis de leucocitos polimorfonucleares (PMN) humanos contra Candida albicans.
• Inmunomodulación In Vivo: Realizada en ratones inmunosuprimidos por ciclofosfamida. Los parámetros incluyeron:
  • Respuesta de Hipersensibilidad de Tipo Retardado (DTH).
  • Títulos de anticuerpos de Hemaglutinación (HA).
  • Parámetros hematológicos (WBC, RBC, Hemoglobina, adhesión de neutrófilos).
  • Perfil de citocinas (IgG, IgM, IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ, TGF-β).

Contribuciones Clave

1. Estandarización: Se establecieron estándares farmacognósticos y huellas dactilares de HPTLC para R. officinalis y H. spinosa recolectadas en las colinas de Nilgiri, proporcionando una base para el control de calidad.
2. Perfil de Seguridad: Se demostró que ambos extractos no son tóxicos hasta 2000 mg/kg (LD₅₀ > 2000 mg/kg) y no exhiben citotoxicidad contra líneas celulares intestinales humanas a concentraciones terapéuticas, manteniendo la viabilidad celular por encima del 90%.
3. Inmunomodulación Comparativa: Proporcionó una comparación directa que muestra que, si bien ambas plantas poseen propiedades inmunomoduladoras, R. officinalis exhibe una eficacia superior en modelos in vivo específicos, particularmente en la restauración de la función inmunitaria comprometida por la ciclofosfamida.
4. Perspectiva Mecanística: Elucidó la acción dual de estos extractos como antioxidantes y estimuladores inmunitarios, vinculando el contenido fitoquímico (fenoles, flavonoides, terpenoides) con la actividad biológica.

Resultos Clave

• Fitoquímica: Ambos extractos fueron ricos en fenoles, flavonoides, alcaloides, saponinas y terpenoides. H. spinosa contenía de forma única carbohidratos y esteroles, mientras que R. officinalis mostró valores de extracto más altos tanto en etanol como en agua. La HPTLC confirmó huellas dactilares químicas distintas y complejas para ambas especies.
• Actividad Antioxidante: Ambos extractos demostraron una actividad moderada de eliminación de radicales libres. H. spinosa mostró un IC₅₀ ligeramente menor (229.5 ± 9.2 µg/mL) en comparación con R. officinalis (231.5 ± 11.6 µg/mL), aunque ambos fueron menos potentes que el estándar Trolox (5.36 µg/mL).
• Citotoxicidad: No se observaron efectos citotóxicos en células HT-29 o Caco-2 a concentraciones de hasta 400 µg/mL, con una viabilidad celular superior al 90%.
• Toxicidad Aguda: No se observó mortalidad ni anomalías conductuales o neurológicas en ratas a dosis de hasta 2000 mg/kg.
• Inmunomodulación In Vitro: Ambos extractos inhibieron la degranulación de los mastocitos y mejoraron la fagocitosis. R. officinalis demostró una estabilización de mastocitos ligeramente superior (79.48% a 400 µg/mL) en comparación con H. spinosa (73.33%).
• Inmunomodulación In Vivo (Modelo de Ciclofosfamida):
  • R. officinalis revirtió significativamente la inmunosupresión inducida por ciclofosfamida de manera dependiente de la dosis (250 y 500 mg/kg).
  • Inmunidad Humoral: Restauró los títulos de anticuerpos de hemaglutinación y los niveles de IgG e IgM.
  • Inmunidad Celular: Mejoró la respuesta DTH y la adhesión de neutrófilos.
  • Modulación de Citocinas: Normalizó los niveles de IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10, y redujo los niveles elevados de TGF-β asociados con la inmunosupresión.
  • Hematología: Revirtió la disminución de WBC, RBC y hemoglobina causada por la ciclofosfamida.
  • H. spinosa no fue probada en el modelo in vivo de ciclofosfamida en este estudio; los datos comparativos in vivo se centran en R. officinalis.

Significancia y Reivindicaciones
Los autores concluyen que tanto Rosmarinus officinalis como Hygrophila spinosa son seguras, no tóxicas y poseen propiedades antioxidantes e inmunomoduladoras significativas, validando su uso tradicional. Sin embargo, el estudio destaca específicamente a R. officinalis por tener un potencial inmunoestimulador superior, particularmente en la restauración de los parámetros inmunitarios en estados inmunosuprimidos. El artículo postula que R. officinalis es un candidato prometedor para la inmunoterapia natural y podría servir como base para el desarrollo de agentes inmunomoduladores derivados de plantas. Los autores sugieren que los efectos observados se deben probablemente a la acción sinérgica de metabolitos secundarios como fenoles, flavonoides y terpenoides. Señalan que, si bien los resultados actuales son prometedores, se requiere mayor investigación que involucre el aislamiento de compuestos bioactivos, la elucidación de mecanismos moleculares, la farmacocinética y estudios de multi-ómica para confirmar plenamente el potencial terapéutico.