Host induced microRNA hsa-miR-643 promotes Mycobacterium tuberculosis survival inside macrophages by downregulating Gins2

Technische Samenvatting: Door de gastheer geïnduceerde microRNA hsa-miR-643 bevordert de overleving van Mycobacterium tuberculosis binnen macrofagen door de downregulatie van Gins2

Probleemstelling
Tuberculose (TBC) blijft een wereldwijde gezondheidscrisis, verergerd door de opkomst van multi-resistente (MDR) en uitgebreid resistente (XDR) stammen van Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Een cruciale factor in de pathogenese van Mtb is het vermogen om te overleven binnen gastheer-macrofagen door de gastheerverdediging te ondermijnen, specifiek door de rijping van het fagosoom te blokkeren en apoptose te vermijden. Hoewel bacteriële genen die deze overleving faciliteren goed gedocumenteerd zijn, blijft de rol van niet-coderende RNA's van de gastheer, in het bijzonder microRNA's (miRNA's), bij de regulatie van deze interactie tussen gastheer en pathogeen nog onvoldoende begrepen. Voorgaand werk door de auteurs identificeerde hsa-miR-643 als significant opgegereguleerd in met Mtb geïnfecteerde menselijke macrofagen (THP-1-cellen), maar de functionele impact en specifieke doelwitten hiervan waren onbekend.

Methodologie
De studie maakte gebruik van een veelzijdige aanpak om de rol van hsa-miR-643 te karakteriseren:

• Cellulaire Modellen: Gedifferentieerde THP-1 menselijke macrofagen werden geïnfecteerd met pathogene Mtb (H37Rv) en niet-pathogene Mtb (H37Ra) stammen.
• Transcriptoomanalyse: Vergelijkende whole-genome RNA-sequencing (RNA-seq) werd uitgevoerd op THP-1-cellen die behandeld waren met Mtb-infectie versus cellen die getransfecteerd waren met hsa-miR-643 mimics. Differentieel tot expressie gebrachte genen werden geïdentificeerd met behulp van de iDEP.96 software met strikte statistische grenswaarden (FDR 0,05, log2 fold-change >1,8 of <-1,8).
• Doelwitvalidatie:
  • qRT-PCR en Western Blot: Gebruikt om mRNA- en eiwitniveaus van kandidaatgenen (specifiek Gins2) te kwantificeren in reactie op Mtb-infectie, hsa-miR-643 mimic transfectie en hsa-miR-643 inhibitor behandeling.
  • Luciferase Reporter Assay: De 1,9 kb 3'-UTR van het menselijke Gins2-gen werd geklononeerd in een pmirGLO-vector. THP-1-cellen werden co-getransfecteerd met dit construct en hsa-miR-643 mimics om directe binding te beoordelen. Een mutant construct zonder de seed-sequentie (pmirGLO:Gins2 3'-UTR∆SS) diende als controle.
• Functionele Assays:
  • Apoptose-analyse: Flowcytometrie met Annexine V/Propidium Iodide kleuring werd gebruikt om de apoptoseratio te meten in cellen behandeld met hsa-miR-643 inhibitoren en geïnfecteerd met Mtb.
  • Bacteriële Overleving: Colony Forming Unit (CFU) assays werden uitgevoerd om de intracellulaire Mtb-belasting te tellen in cellen behandeld met hsa-miR-643 inhibitoren of Gins2 siRNA.

Belangrijkste Resultaten

1. Identificatie van Gins2 als Doelwit: Transcriptoomanalyse toonde aan dat hsa-miR-643 mimics consistent een specifieke set genen downreguleerden. Onder deze genen werd Gins2 (GINS complex subunit 2) geselecteerd voor verdere studie.
2. Directe Regulatie: Experimentele validatie bevestigde dat hsa-miR-643 direct de 3'-UTR van Gins2 target. Luciferase-assays toonden een significante afname van activiteit wanneer hsa-miR-643 mimics aanwezig waren, wat werd hersteld in het mutant construct zonder de bindingsplaats. Bijgevolg werden Gins2 mRNA- en eiwitniveaus significant verlaagd in met Mtb geïnfecteerde cellen en mimic-getransfecteerde cellen, terwijl behandeling met een inhibitor de Gins2-expressie herstelde.
3. Pathogene Specificiteit: De downregulatie van Gins2 werd waargenomen bij de pathogene H37Rv-stam, maar niet bij de niet-pathogene H37Ra-stam, wat dit fenomeen specifiek koppelt aan virulente Mtb-infectie.
4. Impact op Apoptose en Bacteriële Overleving:
   • Inhibitie van hsa-miR-643 leidde tot een duidelijke toename van apoptose in geïnfecteerde THP-1-cellen (stijgend naar ~20% vergeleken met ~5,5% in geïnfecteerde controles).
   • Deze toename in apoptose correleerde met een significante reductie in de intracellulaire overleving van Mtb (lagere CFU-counts).
   • Omgekeerd leidde het uitschakelen van Gins2 via siRNA tot een verhoging van de bacteriële belasting, wat bevestigt dat Gins2-niveaus invers gerelateerd zijn aan de overleving van Mtb.

Betekenis en Claims
Het artikel beweert een nieuw regulatoir mechanisme vast te stellen waarbij Mtb de signaalpaden van de gastheer manipuleert om intracellulaire overleving te garanderen. Specifiek demonstreert de studie dat:

• Mtb-infectie hsa-miR-643 induceert in gastheer-macrofagen.
• Verhoogde hsa-miR-643 de expressie van Gins2 direct onderdrukt.
• De onderdrukking van Gins2 de apoptose van de gastheercel vermindert, waardoor een beschermde niche voor Mtb-replicatie ontstaat.
• Dit mechanisme onderscheidt zich van de respons op avirulente stammen, wat wijst op een specifieke virulentiestrategie.

De auteurs stellen voor dat hsa-miR-643 een veelbelovend therapeutisch doelwit is voor gastheer-gerichte therapie (HDT). Door hsa-miR-643 te remmen, kan de natuurlijke apoptotische defensie van de gastheer worden hersteld om intracellulaire bacteriën te elimineren, wat potentieel een strategie biedt om drug-resistente TBC te bestrijden zonder bacteriële antibioticaresistentie te induceren. Het artikel merkt ook het potentieel op om oncologie-geneesmiddelen die gericht zijn op Gins2 (een gevestigd oncogen) te hergebruiken voor infectieziektenbeheer, hoewel het erkent dat hsa-miR-643 waarschijnlijk andere genen target die bijdragen aan mycobacteriële progressie, hetgeen verder onderzoek rechtvaardigt.