Host induced microRNA hsa-miR-643 promotes Mycobacterium tuberculosis survival inside macrophages by downregulating Gins2

Résumé technique : Le microARN de l'hôte hsa-miR-643 favorise la survie de Mycobacterium tuberculosis à l'intérieur des macrophages en régulant à la baisse Gins2

Énoncé du problème
La tuberculose (TB) demeure une crise sanitaire mondiale, exacerbée par l'augmentation des souches de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) multirésistantes (MDR) et extrêmement résistantes (XDR). Un facteur critique de la pathogenèse de Mtb est sa capacité à survivre au sein des macrophages de l'hôte en subvertissant les défenses de l'hôte, spécifiquement en arrêtant la maturation du phagosome et en échappant à l'apoptose. Bien que les gènes bactériens facilitant cette survie soient bien documentés, le rôle des ARN non codants de l'hôte, particulièrement les microARN (miARN), dans la régulation de cette interaction hôte-pathogène reste mal compris. Des travaux antérieurs par les auteurs ont identifié hsa-miR-643 comme étant significativement régulé à la hausse dans les macrophages humains infectés par Mtb (cellules THP-1), mais son impact fonctionnel et ses cibles spécifiques étaient inconnus.

Méthodologie
L'étude a employé une approche multidimensionnelle pour caractériser le rôle de hsa-miR-643 :

• Modèles cellulaires : Des macrophages humains THP-1 différenciés ont été infectés par des souches pathogènes de Mtb (H37Rv) et non pathogènes de Mtb (H37Ra).
• Analyse du transcriptome : Un séquençage de l'ARN de l'ensemble du génome comparatif (RNA-seq) a été réalisé sur des cellules THP-1 traitées par infection de Mtb versus celles ayant été transfectées avec des mimics de hsa-miR-643. Les gènes exprimés de manière différentielle ont été identifiés à l'aide du logiciel iDEP.96 avec des seuils statistiques stricts (FDR 0,05, log2 fold-change >1,8 ou <-1,8).
• Validation de la cible :
  • qRT-PCR et Western Blot : Utilisés pour quantifier les niveaux d'ARNm et de protéines des gènes candidats (spécifiquement Gins2) en réponse à l'infection par Mtb, à la transfection de mimics de hsa-miR-643 et au traitement par inhibiteur de hsa-miR-643.
  • Essai de l'activité luciférase : L'extrémité 3'-UTR de 1,9 kb du gène humain Gins2 a été clonée dans un vecteur pmirGLO. Des cellules THP-1 ont été co-transfectées avec cette construction et des mimics de hsa-miR-643 pour évaluer la liaison directe. Une construction mutante dépourvue de la séquence de reconnaissance (pmirGLO:Gins2 3'-UTR∆SS) a servi de contrôle.
• Essais fonctionnels :
  • Analyse de l'apoptose : La cytométrie en flux utilisant la coloration Annexine V/Propidium Iodide a été utilisée pour mesurer les taux d'apoptose dans les cellules traitées avec des inhibiteurs de hsa-miR-643 et infectées par Mtb.
  • Survie bactérienne : Des essais d'unités formant colonies (CFU) ont été menés pour dénombrer les charges intracellulaires de Mtb dans les cellules traitées avec des inhibiteurs de hsa-miR-643 ou de l'ARNi ciblant Gins2.

Résultats clés

1. Identification de Gins2 comme cible : L'analyse du transcriptome a révélé que les mimics de hsa-miR-643 régulaient systématiquement à la baisse un ensemble spécifique de gènes. Parmi ceux-ci, Gins2 (sous-unité 2 du complexe GINS) a été sélectionné pour une étude plus approfondie.
2. Régulation directe : La validation expérimentale a confirmé que hsa-miR-643 cible directement la 3'-UTR de Gins2. Les essais de luciférase ont montré une réduction significative de l'activité en présence de mimics de hsa-miR-643, laquelle était restaurée avec la construction mutante dépourvue du site de liaison. Par conséquent, les niveaux d'ARNm et de protéine de Gins2 ont été significativement diminués dans les cellules infectées par Mtb et les cellules transfectées avec des mimics, tandis que le traitement par inhibiteur a restauré l'expression de Gins2.
3. Spécificité pathogène : La régulation à la baisse de Gins2 a été observée avec la souche pathogène H37Rv, mais pas avec la souche non pathogène H37Ra, liant ce phénomène spécifiquement à l'infection virulente par Mtb.
4. Impact sur l'apoptose et la survie bactérienne :
   • L'inhibition de hsa-miR-643 a entraîné une augmentation marquée de l'apoptose dans les cellules THP-1 infectées (passant à environ 20 % contre environ 5,5 % pour les contrôles infectés).
   • Cette augmentation de l'apoptose est corrélée à une réduction significative de la survie intracellulaire de Mtb (comptages de CFU plus faibles).
   • Inversement, le silençage de Gins2 via l'ARNi a augmenté la charge bactérienne, confirmant que les niveaux de Gins2 sont inversement liés à la survie de Mtb.

Signification et revendications
L'article prétend établir un nouvel axe de régulation où Mtb manipule la signalisation des cellules hôtes pour assurer sa survie intracellulaire. Plus précisément, l'étude démontre que :

• L'infection par Mtb induit hsa-miR-643 dans les macrophages de l'hôte.
• L'élévation de hsa-miR-643 supprime directement l'expression de Gins2.
• La suppression de Gins2 atténue l'apoptose des cellules hôtes, créant ainsi une niche protégée pour la réplication de Mtb.
• Ce mécanisme est distinct de la réponse aux souches avirulentes, soulignant une stratégie de virulence spécifique.

Les auteurs proposent que hsa-miR-643 représente une cible thérapeutique prometteuse pour la thérapie dirigée vers l'hôte (HDT). En inhibant hsa-miR-643, la défense apoptotique naturelle de l'hôte pourrait être restaurée pour éliminer les bactéries intracellulaires, offrant potentiellement une stratégie pour combattre la tuberculose résistante aux médicaments sans induire de résistance antibiotique bactérienne. L'article note également le potentiel de repositionnement des médicaments oncologiques ciblant Gins2 (un oncogène établi) pour la gestion des maladies infectieuses, tout en reconnaissant que hsa-miR-643 cible probablement d'autres gènes contribuant à la progression mycobactérienne, ce qui nécessite des investigations supplémentaires.