Optimizing Preprocessing for Urinary Cell-Free DNA Preservation: Centrifugation, EDTA Concentration, Storage and Thawing Strategies

Resumo Técnico: Otimização do Pré-processamento para Preservação de DNA Livre de Células Urinário

Definição do Problema
O DNA livre de células urinário (ucfDNA) representa um biomarcador promissor e não invasivo para a detecção de vários tumores sólidos e condições patológicas. No entanto, a tradução clínica do ucfDNA é atualmente dificultada pela falta de protocolos de pré-processamento padronizados. Diferente do sangue, a urina contém altos níveis de nucleases e microrganismos que degradam rapidamente o ucfDNA, que é inerentemente altamente fragmentado. Estudos anteriores utilizaram vários preservativos (ex: EDTA, estabilizadores comerciais) e métodos de armazenamento, mas permanecem inconsistências em relação às concentrações ideais de EDTA, ao tempo de centrifugação (urina total vs. sobrenadante), temperaturas de congelamento e estratégias de descongelamento. Este estudo aborda a escassez de diretrizes padronizadas avaliando sistematicamente variáveis pré-analíticas para otimizar o rendimento e a pureza do ucfDNA.

Metodologia
O estudo utilizou amostras de urina coletadas de voluntários saudáveis (HVs), que foram agrupadas (pooled) para minimizar a variabilidade interindividual e garantir níveis detectáveis de ucfDNA. O delineamento experimental focou em quatro variáveis pré-analíticas principais:

1. Concentração de EDTA e Tipo de Amostra: A urina total (WU) e o sobrenadante de urina (US) foram tratados com concentrações variadas de EDTA (0, 5, 10, 20 e 40 mM). Estas amostras foram armazenadas à temperatura ambiente (RT) por 1, 3 e 7 dias para simular atrasos na entrega clínica.
2. Estratégias de Descongelamento: Amostras congeladas (Urina Total Congelada [FWU], Sobrenadante de Urina Congelado [FUS] e FUS com centrifugação secundária pós-descongelamento [FUSS]) foram submetidas a três métodos de descongelamento: 4°C (lento), Temperatura Ambiente (RT) e 37°C (rápido). Isso foi testado com e sem 10 mM de EDTA.
3. Armazenamento de Longo Prazo: Amostras de FUS tratadas com EDTA (10 mM) foram armazenadas a -20°C e -80°C por períodos variando de um a três meses.
4. Análise: O ucfDNA foi extraído utilizando o kit Quick-DNA™ Urine. A qualidade foi avaliada via sistema Agilent 4200 TapeStation, medindo o rendimento de DNA total (TDNA), o rendimento de ucfDNA e o "%score de cfDNA" (a proporção de fragmentos entre 50–700 bp em relação ao DNA total).

Resultos Principais

• Degradação sem Preservativos: A urina não tratada (tanto WU quanto US) exibiu degradação completa do ucfDNA em 24 horas à temperatura ambiente (RT).
• EDTA em Urina Total (WU): Embora o EDTA (5–40 mM) tenha evitado a degradação total em WU por até 7 dias, ele falhou em prevenir a lise celular. Consequentemente, os scores de %cfDNA diminuíram significativamente ao longo do tempo devido ao acúmulo de DNA de alto peso molecular (HMW) proveniente de células lisadas. Concentrações mais altas de EDTA (20–40 mM) correlacionaram-se com menores rendimentos de ucfDNA após 7 dias.
• EDTA em Sobrenadante de Urina (US): A centrifugação antes da adição de EDTA provou ser crítica. O US tratado com 10 mM de EDTA manteve rendimentos de ucfDNA e scores de %cfDNA comparáveis ao baseline por 7 dias à temperatura ambiente. No entanto, 40 mM de EDTA prejudicou os rendimentos, sugerindo que existe uma concentração ideal.
• Métodos de Descongelamento:
  • Urina Total Congelada (FWU): O descongelamento a 4°C resultou em uma perda de >60% do rendimento de ucfDNA, provavelmente devido à recristalização do gelo e danos celulares. O descongelamento rápido (RT/37°C) preservou melhor os rendimentos, mas ainda resultou em scores de %cfDNA menores do que o US devido à lise celular.
  • Sobrenadante de Urina Congelado (FUS): Amostras de FUS tratadas com 10 mM de EDTA demonstraram estabilidade robusta em todos os métodos de descongelamento, mantendo rendimentos e pureza equivalentes ao baseline.
  • Centrifugação Secundária (FUSS): A centrifugação secundária pós-descongelamento reduziu significativamente os rendimentos de ucfDNA, particularmente em amostras descongeladas a 4°C (até 80% de perda), provavelmente devido à adsorção do DNA ao sedimento.
    Armazenamento: Amostras de FUS com 10 mM de EDTA armazenadas a -80°C mantiveram a qualidade do baseline por 3 meses. Em contraste, amostras armazenadas a -20°C mostraram degradação após 2 meses e degradação completa após 3 meses.

Principais Contribuições e Significância
Este estudo fornece diretrizes práticas baseadas em evidências para o manuseio de amostras de urina destinadas à análise de ucfDNA, abordando a lacuna crítica na padronização pré-analítica. Os autores reivindicam as seguintes contribuições específicas:

1. A Centrifgação é Primordial: O principal determinante da estabilidade do ucfDNA é a remoção das células antes do armazenamento. Armazenar urina total, mesmo com EDTA, leva à progressiva lise celular e contaminação por DNA HMW, comprometendo a pureza da amostra.
2. Protocolo Otimizado: O estudo recomenda a adição de 10 mM de EDTA ao sobrenadante de urina (US) em vez de urina total. Isso permite o armazenamento temporário à temperatura ambiente por até 7 dias ou o congelamento a -20°C por menos de um mês.
3. Requisitos de Armazenamento de Longo Prazo: Para armazenamento superior a um mês, temperaturas ultra-baixas (-80°C ou nitrogênio líquido) são necessárias para evitar a degradação.
4. Eficiência de Descongelamento: O descongelamento rápido em RT ou 37°C é suficiente e eficaz para amostras de FUS, economizando tempo sem comprometer a qualidade. Por outro lado, o descongelamento lento a 4°C é prejudicial, especialmente para urina total.
5. Eliminação de Etapas Redundantes: O estudo conclui que a centrifugação secundária pós-descongelamento de amostras FUS é desnecessária e contraproducente, pois leva a uma perda significativa de DNA.

Limitações
Os autores observam que o estudo dependeu de urina agrupada de voluntários saudáveis, o que significa que os níveis basais de ucfDNA podem diferir em populações de pacientes. Além disso, o uso de amostras agrupadas limitou o número de réplicas biológicas por grupo. A eficácia das concentrações de EDTA em amostras de pacientes com níveis variados de ucfDNA ainda precisa ser investigada.

Conclusão
Ao definir a interação ideal entre centrifugação, concentração de EDTA, temperatura de armazenamento e métodos de descongelamento, este trabalho oferece um fluxo de trabalho padronizado para maximizar a qualidade do ucfDNA. Os achados sugerem que, embora o EDTA seja eficaz para prevenir a atividade de nuclease, sua utilidade em urina total é limitada pela lise celular, tornando o processamento do sobrenadante de urina a estratégia superior para preservar ucfDNA de alta qualidade para aplicações clínicas.