Optimizing Preprocessing for Urinary Cell-Free DNA Preservation: Centrifugation, EDTA Concentration, Storage and Thawing Strategies

Resumen Técnico: Optimización del Procesamiento Previo para la Preservación de ADN Libre de Células en Orina

Planteamiento del Problema
El ADN libre de células en orina (ucfDNA, por sus siglas en inglés) representa un biomarcador prometedor y no invasivo para la detección de diversos tumores sólidos y condiciones patológicas. Sin embargo, la traslación clínica del ucfDNA se ve actualmente obstaculizada por la falta de protocolos de procesamiento estandarizados. A diferencia de la sangre, la orina contiene altos niveles de nucleasas y microorganismos que degradan rápidamente el ucfDNA, el cual es inherentemente altamente fragmentado. Estudios previos han utilizado diversos preservativos (p. ej., EDTA, estabilizadores comerciales) y métodos de almacenamiento, pero persisten inconsistencias con respecto a las concentraciones óptimas de EDTA, el tiempo de centrifugación (orina completa frente a sobrenadante) y las estrategias de congelación y descongelación. Este estudio aborda la escasez de directrices estandarizadas mediante la evaluación sistemática de las variables preanalíticas para optimizar el rendimiento y la pureza del ucfDNA.

Metodología
El estudio utilizó muestras de orina recolectadas de voluntarios sanos (HVs), las cuales fueron combinadas para minimizar la variabilidad interindividual y asegurar niveles detectables de ucfDNA. El diseño experimental se centró en cuatro variables preanalíticas clave:

1. Concentración de EDTA y Tipo de Muestra: La orina completa (WU) y el sobrenadante de orina (US) fueron tratados con diversas concentraciones de EDTA (0, 5, 10, 20 y 40 mM). Estas muestras se almacenaron a temperatura ambiente (RT) durante 1, 3 y 7 días para simular retrasos en la entrega clínica.
2. Estrategias de Descongelación: Muestras congeladas (Orina Completa Congelada [FWU], Sobrenadante de Orina Congelado [FUS] y FUS con centrifugación secundaria post-descongelación [FUSS]) fueron sometidas a tres métodos de descongelación: 4 °C (lento), Temperatura Ambiente (RT) y 37 °C (rápido). Esto se probó con y sin 10 mM de EDTA.
3. Almacenamiento a Largo Plazo: Muestras de FUS tratadas con EDTA (10 mM) se almacenaron a -20 °C y -80 °C durante periodos que oscilaron entre uno y tres meses.
4. Análisis: El ucfDNA se extrajo utilizando el kit Quick-DNA™ Urine. La calidad se evaluó mediante el sistema Agilent 4200 TapeStation, midiendo el rendimiento de ADN total (TDNA), el rendimiento de ucfDNA y el "% de puntuación de cfDNA" (la proporción de fragmentos entre 50 y 700 pb en relación con el ADN total).

Resultados Clave

• Degradación sin Preservativos: La orina no tratada (tanto WU como US) exhibió una degradación completa del ucfDNA en 24 horas a temperatura ambiente (RT).
• EDTA en Orina Completa (WU): Aunque el EDTA (5–40 mM) evitó la degradación total en la WU durante hasta 7 días, no logró prevenir la lisis celular. En consecuencia, las puntuaciones de % de cfDNA disminuyeron significativamente con el tiempo debido a la acumulación de ADN de alto peso molecular (HMW) proveniente de las células lisadas. Las concentraciones más altas de EDTA (20–40 mM) se correlacionaron con menores rendimientos de ucfDNA después de 7 días.
• EDTA en Sobrenadante de Orina (US): La centrifugación previa a la adición de EDTA resultó crítica. El US tratado con 10 mM de EDTA mantuvo los rendimientos de ucfDNA y las puntuaciones de % de cfDNA comparables al valor basal durante 7 días a temperatura ambiente. Sin embargo, el EDTA a 40 mM afectó negativamente los rendimientos, lo que sugiere la existencia de una concentración óptima.
• Métodos de Descongelación:
  • Orina Completa Congelada (FWU): La descongelación a 4 °C resultó en una pérdida de rendimiento de ucfDNA superior al 60%, probablemente debido a la recristalización del hielo y al daño celular. La descongelación rápida (RT/37 °C) preservó mejor los rendimientos, pero aun así resultó en puntuaciones de % de cfDNA más bajas en comparación con el US debido a la lisis celular.
  • Sobrenadante de Orina Congelado (FUS): Las muestras de FUS tratadas con 10 mM de EDTA demostraron una robustez estable en todos los métodos de descongelación, manteniendo rendimientos y pureza equivalentes al valor basal.
  • Centrifugación Secundaria (FUSS): La centrifugación secundaria post-descongelación redujo significativamente los rendimientos de ucfDNA, particularmente en muestras descongeladas a 4 °C (pérdida de hasta el 80%), probablemente debido a la adsorción del ADN al sedimento.
• Condiciones de Almacenamiento: Las muestras de FUS con 10 mM de EDTA almacenadas a -80 °C mantuvieron la calidad basal durante 3 meses. Por el contrario, las muestras almacenadas a -20 °C mostraron degradación tras 2 meses y una degradación completa tras 3 meses.

Contribuciones Clave y Significado
Este estudio proporciona directrices prácticas basadas en evidencia para el manejo de muestras de orina destinadas al análisis de ucfDNA, abordando la brecha crítica en la estandarización preanalítica. Los autores sostienen las siguientes contribuciones específicas:

1. La Centrifugación es Primordial: El determinante principal de la estabilidad del ucfDNA es la eliminación de las células antes del almacenamiento. Almacenar la orina completa, incluso con EDTA, conduce a la lisis celular progresiva y a la contaminación con ADN de alto peso molecular (HMW), comprometiendo la pureza de la muestra.
2. Protocolo Optimizado: El estudio recomienda añadir 10 mM de EDTA al sobrenadante de orina (US) en lugar de a la orina completa. Esto permite el almacenamiento temporal a temperatura ambiente por hasta 7 días o la congelación a -20 °C por menos de un mes.
3. Requisitos de Almacenamiento a Largo Plazo: Para el almacenamiento superior a un mes, son necesarias temperaturas ultra bajas (-80 °C o nitrógeno líquido) para prevenir la degradación.
4. Eficiencia de la Descongelación: La descongelación rápida a temperatura ambiente o a 37 °C es suficiente y efectiva para las muestras de FUS, ahorrando tiempo sin comprometer la calidad. Por el contrario, la descongelación lenta a 4 °C es perjudicial, especialmente para la orina completa.
5. Eliminación de Pasos Redundantes: El estudio concluye que la centrifugación secundaria post-descongelación de las muestras de FUS es innecesaria y contraproducente, ya que provoca una pérdida significativa de ADN.

Limitaciones
Los autores señalan que el estudio se basó en orina combinada de voluntarios sanos, lo que significa que los niveles basales de ucfDNA pueden diferir en poblaciones de pacientes. Además, el uso de muestras combinadas limitó el número de réplicas biológicas por grupo. La eficacia de las concentraciones de EDTA en muestras de pacientes con niveles variables de ucfDNA aún debe investigarse más a fondo.

Conclusión
Al definir la interacción óptima entre la centrifugación, la concentración de EDTA, la temperatura de almacenamiento y los métodos de descongelación, este trabajo ofrece un flujo de trabajo estandarizado para maximizar la calidad del ucfDNA. Los hallazgos sugieren que, si bien el EDTA es eficaz para prevenir la actividad de las nucleasas, su utilidad en la orina completa es limitada por la lisis celular, lo que convierte el procesamiento del sobrenadante de orina en la estrategia superior para preservar un ucfDNA de alta calidad para aplicaciones clínicas.