Optimizing Preprocessing for Urinary Cell-Free DNA Preservation: Centrifugation, EDTA Concentration, Storage and Thawing Strategies

技術要約：尿中細胞遊離DNA（ucfDNA）保存のための前処理の最適化

問題提起
尿中細胞遊離DNA（ucfDNA）は、様々な固形癌や病理学的状態の検出における非侵襲的なリキッドバイオプシーの有望なバイオマーカーである。しかし、ucfDNAの臨床応用は、現在、標準化された前処理プロトコルの欠如によって妨げられている。血液とは異なり、尿にはucfDNAを急速に分解させる高レベルのヌクレアーゼや微生物が含まれており、ucfDNA自体も本質的に高度に断片化されている。これまでの研究では、様々な保存剤（例：EDTA、市販の安定剤）や保存方法が用いられてきたが、最適なEDTA濃度、遠心分離のタイミング（全尿か上清か）、凍結温度、および解凍戦略に関して、依然として不一致が存在する。本研究は、前解析変数を体系的に評価することで、ucfDNAの収量と純度を最適化し、標準化されたガイドラインの不足という課題に対処するものである。

方法論
本研究では、個体間の変動を最小限に抑え、検出可能なucfDNAレベルを確保するために、健康なボランティア（HV）から収集された尿をプールして使用した。実験デザインは、以下の4つの主要な前解析変数に焦点を当てた。

1. EDTA濃度とサンプルタイプ： 全尿（WU）および尿上清（US）に対し、異なる濃度のEDTA（0、5、10、20、40 mM）を添加した。これらのサンプルは、臨床現場での配送遅延をシミュレートするため、室温（RT）で1、3、7日間保存された。
2. 解凍戦略： 凍結サンプル（凍結全尿 [FWU]、凍結尿上清 [FUS]、および解凍後の二次遠心分離を行うFUS [FUSS]）に対し、3つの解凍方法（4°C［緩慢］、室温 [RT]、37°C［迅速］）を適用した。これは、10 mM EDTAの有無の両方でテストされた。
3. 長期保存： EDTA処理（10 mM）を施したFUSサンプルを、-20°Cおよび-80°Cで1ヶ月から3ヶ月の期間保存した。
4. 分析： ucfDNAの抽出にはQuick-DNA™ Urine Kitを使用した。品質評価はAgilent 4200 TapeStationシステムを用いて行い、総DNA（TDNA）収量、ucfDNA収量、および「%cfDNAスコア」（全DNAに対する50–700 bpの断片の割合）を測定した。

主な結果

• 保存剤なしの場合の分解： 未処理の尿（WUおよびUSの両方）は、室温において24時間以内にucfDNAが完全に分解した。
• 全尿（WU）におけるEDTA： EDTA（5–40 mM）は、WUにおける完全な分解を最大7日間は防いだが、細胞溶解を防ぐことはできなかった。その結果、溶血細胞からの高分子量（HMW）DNAの蓄積により、%cfDNAスコアは時間の経過とともに著しく低下した。高いEDTA濃度（20–40 mM）は、7日後のucfDNA収量の低下と相関していた。
• 尿上清（US）におけるEDTA： EDTA添加前の遠心分離が極めて重要であった。10 mM EDTAで処理されたUSは、室温で7日間保存しても、ベースラインと同等のucfDNA収量および%cfDNAスコアを維持した。しかし、40 mM EDTAは収量を損なったため、最適な濃度が存在することが示唆された。
• 解凍方法：
  • 凍結全尿（FWU）： 4°Cでの解凍は、氷の再結晶化と細胞損傷により、ucfDNA収量の60%以上の損失を招いた。迅速な解凍（RT/37°C）は収量をより良く保持したが、細胞溶解のため、USと比較すると%cfDNAスコアは依然として低かった。
  • 凍結尿上清（FUS）： 10 mM EDTAで処理されたFUSサンプルは、すべての解凍方法において堅牢な安定性を示し、ベースラインと同等の収量と純度を維持した。
  • 二次遠心分離（FUSS）： 解凍後の二次遠心分離は、特に4°Cで解凍されたサンプルにおいて、DNAが沈殿物に吸着することによるものと思われる大幅なucfDNA収量の減少（最大80%の損失）を引き起こした。
• 保存条件： 10 mM EDTAで処理されたFUSサンプルを-80°Cで保存した場合、3ヶ月間ベースラインと同等の品質を維持した。対照的に、-20°Cで保存されたサンプルは、2ヶ月後に分解が見られ、3ヶ月後には完全な分解に至った。

主要な貢献と意義
本研究は、ucfDNA分析のための尿サンプルの取り扱いに関する、実践的かつエビデンスに基づいたガイドラインを提供し、前解析の標準化における決定的なギャップを埋めるものである。著者らは以下の具体的な貢献を主張している。

1. 遠心分離が極めて重要： ucfDNAの安定性を決定する主要因は、保存前の細胞除去である。全尿を保存する場合、たとえEDTAを使用しても、進行的な細胞溶解とHMW DNAの混入が生じ、サンプルの純度を損なう。
2. 最適化されたプロトコル： 全尿ではなく、尿上清（US）に10 mM EDTAを添加することを推奨する。これにより、室温で最大7日間の一次保管、または-20°Cでの1ヶ月未満の凍結保存が可能となる。
3. 長期保存の要件： 1ヶ月を超える保存には、分解を防ぐために超低温（-80°Cまたは液体窒素）が必要である。
4. 解凍の効率性： FUSサンプルについては、RTまたは37°Cでの迅速解凍が、品質を損なうことなく効果的であり、時間を節約できる。逆に、4°Cでの緩慢な解凍は、特に全尿において有害である。
5. 冗長なステップの排除： 本研究は、FUSサンプルに対する解凍後の二次遠心分離は不要であり、むしろ逆効果である（大幅なDNA損失を招くため）と結論付けている。

限界
著者らは、本研究が健康なボランティアのプールされた尿に依存しているため、患者集団におけるベースラインのucfDNAレベルが異なる可能性があることを指摘している。また、プールされたサンプルを使用しているため、グループあたりの生物学的反復数が限られている。様々なucfDNAレベルを持つ患者サンプルにおけるEDTA濃度の有効性については、さらなる調査が必要である。

結論
遠心分離、EDTA濃度、保存温度、および解凍方法の最適な相互作用を定義することにより、本研究はucfDNAの品質を最大化するための標準化されたワークフローを提供する。研究結果は、EDTAはヌクレアーゼ活性を防ぐには有効であるが、全尿における有用性は細胞溶解によって制限されるため、高品質なucfDNAを臨床応用のために保存するには、尿上清の処理が優れた戦略であることを示唆している。