Transcriptomic insights into gametogenesis and steroidogenic enzyme gene regulation in Australasian snapper (Chrysophrys auratus) gonads during the reproductive cycle

Resumo Técnico: Insights Transcriptômicos sobre a Gametogênese e a Regulação Gênica de Enzimas Esteroidogênicas em Gônadas de Papros (Chrysophrys auratus) do Australasia

Definição do Problema
O papros do Australasia (Chrysophrys auratus) é uma espécie prioritária para a diversificação da aquicultura na Nova Zelândia. Embora a fisiologia reprodutiva do papros tenha sido caracterizada fenotipicamente, os mecanismos moleculares que impulsionam a gametogênese e a dinâmica específica da expressão gênica ao longo do ciclo reprodutivo permanecem inexplorados. Diferentemente de seu parente próximo, o pargo vermelho (Pagrus major), que possui uma indústria de reprodução bem estabelecida, o papros carece de um recurso transcriptômico abrangente. Além disso, os controles regulatórios da biossíntese de esteroides sexuais, particularmente o papel da aromatase gonadal (cyp19a1a) em relação aos níveis plasmáticos de estradiol-17β (E2), são desconhecidos nesta espécie. Este estudo aborda a lacuna no conhecimento molecular necessária para avançar no manejo de reprodutores e compreender a diferenciação sexual em papros em cativeiro.

Metodologia
O estudo utilizou uma coorte de 84 papros criados em cativeiro (42 fêmeas e 42 machos) amostrados ao longo de seu ciclo de desova inicial sob condições de fotoperíodo e temperatura ambientes. O tecido gonadal foi coletado em estágios específicos de desenvolvimento:

• Fêmeas: Cinco estágios de oogênese (F1: imaturo; F2: repouso pós-desova; F3: em desenvolvimento; F4: desenvolvido/vitelogênico; F5: desova).
• Machos: Três estágios de espermatogênese (M2: repouso pós-desova; M3: em desenvolvimento; M4: desenvolvido). Nota: O estágio M1 (imaturo) não foi amostrado devido a limitações.

Fluxo de Trabalho Experimental:

1. Sequenciamento de RNA: O RNA total foi extraído de tecidos gonadais e sequenciado na plataforma Illumina NovaSeq para gerar leituras pareadas de 150 bp.
2. Anotação do Genoma: Os autores melhoraram a anotação existente do genoma do papros utilizando o pipeline BRAKER3, integrando dados de RNA-seq de tecidos de cérebro, pituitária e gônadas com evidência proteica de OrthoDB. O Liftoff foi usado para mapear as anotações do pargo amarelo (Acanthopagrus latus) para o genoma do papros. O OrthoFinder foi empregado para identificar grupos ortólogos usando o peixe-zebra (Danio rerio) como referência.
3. Quantificação e Expressão Diferencial: A expressão gênica foi quantificada usando o pipeline nf-core/rnaseq (STAR e Salmon). A análise de expressão diferencial (DEA) foi realizada com DESeq2 para identificar genes com viés sexual e genes diferencialmente expressos (DEGs) específicos de estágio entre os estágios gametogênicos.
4. Análise Funcional: Análises de enriquecimento de Ontologia Gênica (GO) e do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) foram conduzidas usando o clusterProfiler para interpretar os processos biológicos associados aos DEGs.
5. Análise de Genes-Alvo: Enzimas esteroidogênicas específicas (ex: star, cyp11a1.2, cyp17a1, hsd3b1, cyp19a1a, cyp11b1, hsd11b2) e receptores hormonais (fshr, lhcgr, ar, esr1, esr2a) foram analisados individualmente usando contagens de genes normalizadas e testes estatísticos (ANOVA ou Kruskal-Wallis com correções pós-hoc).

Principais Resultados

• Anotação do Genoma: O estudo anotou com sucesso 26.418 genes codificadores de proteínas no genoma do papros, com 97,8% dos BUSCOs identificados como completos. Este recurso fornece uma base para estudos genômicos futuros.
• Expressão com Viés Sexual: O perfil transcriptômico revelou o agrupamento distinto das gônadas de machos e fêmeas. Houam 3.588 DEGs regulados positivamente em fêmeas e 3.938 em machos.
  • Fêmeas: O número de DEGs regulados positivamente aumentou conforme a oogênese progrediu, atingindo o pico durante o estágio de desova (F5). O enriquecimento funcional destacou a regulação positiva de processos ribossomais e genes associados ao metabolismo.
  • Machos: O maior número de DEGs regulados positivamente ocorreu nos estágios iniciais de desenvolvimento (M3) e desenvolvidos (M4). A análise de enriquecimento indicou a regulação positiva de genes relacionados à motilidade celular e morfogênese, consistentes com processos espermigênicos.
• Expressão de Enzimas Esteroidogênicas:
  • Nas fêmeas, a maioria dos genes envolvidos na síntese de testosterona (star, cyp11a1.2, cyp17a1, hsd3b1) aumentou significativamente conforme a oogênese progrediu, atingindo o pico na desova.
  • Exceção Notável: O gene da aromatase gonadal, cyp19a1a, não apresentou variação significativa na expressão em nenhum dos estágios gametogênicos em fêmeas, apesar dos altos níveis de expressão geral. Isso contrasta com a flutuação conhecida dos níveis de estradiol-17β (E2) plasmático no papros e os padrões de expressão de cyp19a1a no pargo vermelho.
  • Nos machos, os padrões de expressão foram menos regulares. O cyp11b1 (envolvido na síntese de 11-KT) foi regulado negativamente no estágio desenvolvido (M4), enquanto o hsd11b2 foi regulado positivamente no estágio de repouso pós-desova (M2).
• Receptores Hormonais:
  • O fshr (receptor de FSH) foi altamente expresso em machos em comparação com fêmeas.
  • Nas fêmeas, a expressão de lhcgr e esr1 aumentou ao longo do ciclo, atingindo o pico na desova (F5).
  • O receptor de andrógeno (ar) foi expresso em níveis mais altos em fêmeas no geral, comparado aos machos.

Significância e Alegações
Os autores afirmam que este estudo fornece a primeira exploração em nível de transcriptoma das gônadas do papros ao longo de um ciclo reprodutivo. As principais contribuições são:

1. Geração de Recursos: A anotação aprimorada do genoma (26.418 genes) serve como uma ferramenta crítica para estudos futuros no papros, estendendo-se além da pesquisa reprodutiva.
2. Insights Moleculares: A identificação da expressão gênica com viés sexual e dos DEGs específicos de estágio oferece uma base molecular para compreender a gametogênese. Os autores sugerem que esses perfis poderiam potencialmente ser usados para diferenciar os sexos em juvenis de papros antes da inversão sexual, embora isso seja proposto como uma aplicação futura dos dados, e não como um resultado demonstrado.
3. Descoberta de Mecanismos Regulatórios: O estudo desafia a suposição de que a expressão de cyp19a1a impulsiona as flutuações de E2 no papros, como observado em outras espécies. A expressão constante de cyp19a1a, apesar do aumento dos níveis de E2, sugere que a síntese de E2 no papros pode ser regulada pela disponibilidade de precursores (ex: testosterona ou estrona) ou por mecanismos pós-transcricionais, em vez de controle transcricional do gene da aromatase.
4. Utilidade para a Aquicultura: Ao caracterizar o panorama transcriptômico da reprodução em cativeiro, o estudo estabelece as bases para o desenvolvimento de métodos para controlar o tempo reprodutivo e a diferenciação sexual na aquicultura, abordando um gargalo fundamental na domesticação do papros.

O artigo mantém um tom modesto quanto às implicações futuras, observando que a abordagem de RNA-seq de massa limita a capacidade de resolver mudanças de expressão célula-específicas (ex: dentro de estágios específicos de folículos) e que a natureza altamente assíncrona da espermatogênese do papros complica o isolamento de eventos moleculares específicos no nível de célula única. Os autores sugerem que trabalhos futuros utilizando sequenciamento de RNA de célula única ou técnicas de separação de folículos seriam necessários para elucidar ainda mais esses mecanismos.