Transcriptomic insights into gametogenesis and steroidogenic enzyme gene regulation in Australasian snapper (Chrysophrys auratus) gonads during the reproductive cycle

技術的要約：オーストラリアン・スナッパー（Chrysophrys auratus）の生殖腺における配偶子形成およびステロイド合成酵素遺伝子の制御に関するトランスクリプトーム解析

問題提起
オーストラリアン・スナッパー（Chrysophrys auratus）は、ニュージーランドにおける養殖多様化のための優先種である。スナッパーの生殖生理は表現型としては特徴付けられているが、配偶子形成を駆動する分子メカニズムや、生殖周期を通じた特定の遺伝子発現ダイナミクスについては未解明である。近縁種であり、確立された繁殖産業を持つアカダイ（Pagrus major）とは異なり、スナパーには包括的なトランスクリプトーム・リソースが欠如している。さらに、血漿エストラジオール-17β（E2）レベルに関連する、性ステロイド生合成（特に性腺アロマターゼ cyp19a1a の役割）の調節制御についても不明である。本研究は、飼育下におけるスナッパーの種苗管理を進め、性的分化を理解するために必要な分子学的知見の空白を埋めるものである。

方法論
本研究では、自然な光周期および温度条件下での初産周期における、飼育繁殖されたスナッパーのコホート84個体（雌42、雄42）を利用した。生殖細胞の発達段階に応じて生殖腺組織を採取した：

• 雌： 卵形成の5段階（F1：未熟、F2：産卵後の休止期、F3：発達期、F4：成熟・卵黄形成期、F5：産卵期）。
• 雄： 精子形成の3段階（M2：産卵後の休止期、M3：発達期、M4：成熟期）。注：M1（未熟）は制限のためサンプリングしていない。

実験ワークフロー：

1. RNAシーケンシング： 全RNAを脳、下垂体、生殖腺の組織から抽出し、Illumina NovaSeqプラットフォームを用いて150 bpのペアエンドリードとしてシーケンシングした。
2. ゲノムアノテーション： BRAKER3パイプラインを用いて既存のスナッパーゲノムアノテーションを改良し、RNA-seqデータ（脳、下垂体、生殖腺由来）とOrthoDBからのタンパク質エビデンスを統合した。Liflifを用いて、キイロダイ（Acanthopagrus latus）のアノテーションをスナッパーゲノムにマッピングした。OrthoFinderを用い、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）をリファレンスとしてオーソロググループを特定した。
3. 定量化および発現解析： 遺伝子発現量は、nf-core/rnaseqパイプライン（STARおよびSalmon）を用いて定量化した。性差のある遺伝子および段階特異的な発現変動遺伝子（DEG）を特定するため、DESeq2を用いた差発現解析（DEA）を実施した。
4. 機能解析： DEGに関連する生物学的プロセスを解釈するため、clusterProfilerを用いた遺伝子オントロジー（GO）および京都遺伝子・ゲノム百科事典（KEGG）の濃縮解析を行った。
5. 標的遺伝子解析： 特定のステロイド合成酵素（例：star, cyp11a1.2, cyp17a1, hsd3b1, cyp19a1a, cyp11b1, hsd11b2）およびホルモン受容体（fshr, lhcgr, ar, esr1, esr2a）を、正規化された遺伝子カウントと統計検定（ANOVAまたは事後補正を伴うKruskal-Wallis検定）を用いて個別に解析した。

主な結果

• ゲノムアノテーション： 本研究は、スナッパーゲノムにおいて26,418個のタンパク質コード遺伝子のアノテーションに成功し、BUSCOの97.8%を完全なものとして特定した。このリソースは、将来的なゲノム研究の基礎となる。
• 性差のある発現： トランスクリプトーム・プロファイリングにより、雄と雌の生殖腺の明確なクラスタリングが明らかになった。雌では3,588個、雄では3,938個のアップレギュレートされたDEGが確認された。
  • 雌： 卵形成の進行に伴いアップレギュレートされたDEGの数が増加し、産卵期（F5）でピークに達した。機能的濃縮解析では、リボソームプロセスおよび代謝関連遺伝子のアップレギュレーションが強調された。
  • 雄： アップレギュレートされたDEGの数は、初期発達期（M3）および成熟期（M4）に最大となった。濃縮解析は、精子形成プロセスと一致する細胞運動および形態形成に関連する遺伝子のアップレギュレーションを示した。
• ステロイド合成酵素の発現：
  • 雌においては、ほとんどのテストステロン合成に関与する遺伝子（star, cyp11a1.2, cyp17a1, hsd3b1）が卵形成の進行とともに有意に増加し、産卵期にピークに達した。
  • 注目すべき例外： 雌の生殖腺アロマターゼ遺伝子である cyp19a1a は、高い全体的な発現レベルにもかかわらず、雌のどの配偶子形成段階においても有意な発現変動を示さなかった。これは、スナッパーにおける血漿E2レベルの変動およびアカダイにおける cyp19a1a の発現パターンとは対照的である。
  • 雄においては、発現パターンはあまり規則的ではなかった。cyp11b1（11-KT合成に関与）は成熟期（M4）にダウンレギュレートされ、hsd11b2 は産卵後の休止期（M2）にアップレギュレートされた。
• ホルモン受容体：
  • fshr（FSH受容体）は、雌と比較して雄において高い発現を示した。
  • 雌においては、lhcgr および esr1 の発現が周期を通じて増加し、産卵期（F5）にピークに達した。
  • アンドロゲン受容体（ar）は、雄よりも全体として雌において高いレベルで発現していた。

意義および主張
著者らは、本研究が配偶子形成サイクルを通じたスナッパー生殖腺の初のトランスクリプトーム全域探索であると主張している。主な貢献は以下の通りである：

1. リソースの生成： 改良されたゲノムアノテーション（26,418遺伝子）は、生殖研究を超えて、将来的なスナッパー研究のための重要なツールとして機能する。
2. 分子学的知見： 性差のある遺伝子発現および段階特異的なDEGの特定は、配偶子形成を理解するための分子基盤を提供する。著者らは、これらのプロファイルが、性転換前の幼魚における性別判別に利用できる可能性を示唆しているが、これは実証された結果ではなく、将来的な応用として提案されているものである。
3. 調節メカニズムの発見： 本研究は、他の種で見られるように cyp19a1a の発現がスナッパーのE2変動を駆動するという仮説に疑問を投げかける。E2レベルの上昇にもかかわらず cyp19a1a の発現が一定であることは、スナッパーにおけるE2合成が、アロマターゼ遺伝子の転写制御ではなく、前駆体（例：テストステロンやエストロン）の可用性や翻訳後メカニズムによって制御されている可能性を示唆している。
4. 養殖への有用性： 飼育下の繁殖特性を明らかにすることで、本研究は、スナッパーの家畜化における主要なボトルネックである、繁殖時期や性的分化の制御手法の開発に向けた基礎を築くものである。

論文は、バルクRNA-seqアプローチが細胞特異的な発現シフト（例：特定の卵胞段階内の変化）を解明する能力を制限すること、およびスナッパーの極めて非同期的な精子形成が単一細胞レベルでの特定の分子イベントの分離を困難にすることを述べ、将来的な影響については控えめなトーンを維持している。著者らは、これらのメカニズムをさらに解明するためには、シングルセルRNAシーケンシングや卵胞分離技術を用いた将来の研究が必要であると示唆している。