Transcriptomic insights into gametogenesis and steroidogenic enzyme gene regulation in Australasian snapper (Chrysophrys auratus) gonads during the reproductive cycle

Resumen Técnico: Perspectivas Transcriptómicas de la Gametogénesis y la Regulación Génica de las Enzimas Esteroideo-génicas en las Gónadas del Pargo Austral (Chrysophrys auratus)

Planteamiento del Problema
El pargo austral (Chrysophrys auratus) es una especie prioritaria para la diversificación de la acuicultura en Nueva Zelanda. Aunque la fisiología reproductiva del pargo ha sido caracterizada fenotípicamente, los mecanismos moleculares que impulsan la gametogénesis y la dinámica específica de la expresión génica a lo largo del ciclo reproductivo permanecen inexplorados. A diferencia de su pariente cercano, el pargo rojo (Pagrus major), que posee una industria de cría bien establecida, el pargo carece de un recurso transcriptómico exhaustivo. Además, se desconocen los controles regulatorios de la biosíntesis de esteroides sexuales, particularmente el papel de la aromatasa gonadal (cyp19a1a) en relación con los niveles de estradiol-17β (E2) en plasma. Este estudio aborda la brecha en el conocimiento molecular necesario para avanzar en el manejo de los reproductores y comprender la diferenciación sexual en el pargo en cautiverio.

Metodología
El estudio utilizó una cohorte de 84 pargos criados en cautiverio (42 hembras y 42 machos) muestreados a lo largo de su ciclo de desove inicial bajo condiciones de fotoperiodo y temperatura ambiental. El tejido gonadal se recolectó en etapas específicas de desarrollo:

• Hembras: Cinco etapas de oogénesis (F1: inmadura; F2: reposo post-desove; F3: en desarrollo; F4: desarrollada/vitelogénica; F5: desove).
• Machos: Tres etapas de espermatogénesis (M2: reposo post-desove; M3: en desarrollo; M4: desarrollada). Nota: No se muestreó M1 (inmadura) debido a limitaciones.

Flujo de Trabajo Experimental:

1. Secuenciación de ARN: El ARN total se extrajo de los tejidos gonadales y se secuenció en la plataforma Illumina NovaSeq para generar lecturas de extremos emparejados (paired-end) de 150 pb.
2. Anotación del Genoma: Los autores mejoraron la anotación existente del genoma del pargo utilizando el pipeline BRAKER3, integrando datos de RNA-seq de tejidos de cerebro, pituitaria y gónadas con evidencia de proteínas de OrthoDB. Se utilizó Liftoff para mapear las anotaciones del pargo amarillo (Acanthopagrus latus) al genoma del pargo. Se empleó OrthoFinder para identificar grupos ortólogos utilizando al pez cebra (Danio rerio) como referencia.
3. Cuantificación y Expresión Diferencial: La cuantificación de la expresión génica se realizó mediante el pipeline nf-core/rnaseq (STAR y Salmon). El análisis de expresión diferencial (DEA) se llevó a cabo con DESeq2 para identificar genes con sesgo sexual y genes expresados diferencialmente (DEG) específicos de la etapa entre las etapas gametogénicas.
4. Análisis Funcional: Se realizaron análisis de enriquecimiento de Ontología Génica (GO) y de la Enciclopedia de Genes y Vías de Kyoto (KEGG) utilizando clusterProfiler para interpretar los procesos biológicos asociados con los DEG.
5. Análisis de Genes Diana: Se analizaron individualmente enzimas esteroidogénicas específicas (p. ej., star, cyp11a1.2, cyp17a1, hsd3b1, cyp19a1a, cyp11b1, hsd11b2) y receptores hormonales (fshr, lhcgr, ar, esr1, esr2a) utilizando conteos de genes normalizados y pruebas estadísticas (ANOVA o Kruskal-Wallis con correcciones post-hoc).

Resultos Clave

• Anotación del Genoma: El estudio anotó con éxito 26,418 genes codificantes de proteínas en el genoma del pargo, con un 97.8% de BUSCOs identificados como completos. Este recurso proporciona una base para futuros estudios genómicos.
• Expresión con Sesgo Sexual: El perfil transcriptómico reveló una agrupación distinta de las gónadas de machos y hembras. Se identificaron 3,588 DEG sobreexpresados en hembras y 3,938 en machos.
  • Hembras: El número de DEG sobreexpresados aumentó a medida que progresaba la oogénesis, alcanzando su máximo durante la etapa de desove (F5). El enriquecimiento funcional destacó la regulación al alza de los procesos ribosomales y los genes asociados al metabolismo.
  • Machos: El mayor número de DEG sobreexpresados ocurrió en las etapas de desarrollo temprano (M3) y desarrollada (M4). El análisis de enriquecimiento indicó la regulación al alza de genes relacionados con la motilidad celular y la morfogénesis, consistentes con los procesos espermiogénicos.
• Expresión de Enzimas Esteroidogénicas:
  • En las hembras, la mayoría de los genes involucrados en la síntesis de testosterona (star, cyp11a1.2, cyp17a1, hsd3b1) aumentaron significativamente a medida que progresaba la oogénesis, alcanzando su pico en el desove.
  • Excepción Notable: El gen de la aromatasa gonadal, cyp19a1a, no mostró variaciones significativas en su expresión en ninguna de las etapas gametogénicas en las hembras, a pesar de sus altos niveles de expresión general. Esto contrasta con las fluctuaciones conocidas de los niveles de E2 en plasma en el pargo y los patrones de expresión de cyp19a1a en el pargo rojo.
  • En los machos, los patrones de expresión fueron menos regulares. cyp11b1 (involucrado en la síntesis de 11-KT) se reguló a la baja en la etapa desarrollada (M4), mientras que hsd11b2 se reguló al alza en la etapa de reposo post-desove (M2).
• Receptores Hormonales:
  • fshr (receptor de FSH) presentó una alta expresión en machos en comparación con las hembras.
  • En las hembras, la expresión de lhcgr y esr1 aumentó a lo largo del ciclo, alcanzando su máximo en el desove (F5).
  • El receptor de andrógenos (ar) se expresó en niveles más altos en las hembras en general en comparación con los machos.

Significancia y Reivindicaciones
Los autores afirman que este estudio constituye la primera exploración a nivel de transcriptoma de las gónadas del pargo a lo largo de un ciclo reproductivo. Las principales contribuciones son:

1. Generación de Recursos: La mejora en la anotación del genoma (26,418 genes) sirve como una herramienta crítica para futuros estudios sobre el pargo, extendiéndose más allá de la investigación reproductiva.
2. Perspectivas Moleculares: La identificación de la expresión génica con sesgo sexual y los DEG específicos de cada etapa ofrece una base molecular para comprender la gametogénesis. Los autores sugieren que estos perfiles podrían utilizarse potencialmente para diferenciar los sexos en juveniles de pargo antes de la inversión sexual, aunque esto se propone como una aplicación futura de los datos y no como un resultado demostrado.
3. Descubrimiento de Mecanismos Regulatorios: El estudio desafía la suposición de que la expresión de cyp19a1a impulsa las fluctuaciones de E2 en el pargo, como ocurre en otras especies. La expresión constante de cyp19a1a a pesar del aumento de los niveles de E2 sugiere que la síntesis de E2 en el pargo puede estar regulada por la disponibilidad de precursores (por ejemplo, testosterona o estrona) o por mecanismos post-transcripcionales, en lugar del control transcripcional del gen de la aromatasa.
4. Utilidad para la Acuicultura: Al caracterizar el panorama transcriptómico de la reproducción en cautiverio, el estudio sienta las bases para desarrollar métodos que permitan controlar el tiempo de reproducción y la diferenciación sexual en entornos de acuicultura, abordando un cuello de botella clave en la domesticación del pargo.

El artículo mantiene un tono modesto respecto a las implicaciones futuras, señalando que el enfoque de RNA-seq de masa limita la capacidad de resolver los cambios de expresión a nivel celular (por ejemplo, dentro de las etapas específicas de los folículos) y que la naturaleza altamente asincrónica de la espermatogénesis del pargo complica el aislamiento de eventos moleculares específicos a nivel de célula única. Los autores sugieren que trabajos futuros que utilicen la secuenciación de ARN de célula única o técnicas de separación de folículos serían necesarios para dilucidar mejor estos mecanismos.