Rapid host species identification from dried bloodspots of Culex mosquito blood meals using Mid-Infrared Spectroscopy

Resumo Técnico: Identificação Rápida de Espécies de Hospedeiros em Refeições de Sangue de Mosquitos Culex Usando Espectroscopia de Infravermelho Médio

Definição do Problema
Compreender as preferências de alimentação de sangue dos mosquitos é fundamental para inferir a dinâmica de transmissão de patógenos transmitidos por vetores e otimizar estratégias de intervenção. Embora os mosquitos Culex sejam vetores primários para patógenos de alta prioridade que afetam múltiplos hospedeiros (ex: vírus da encefalite japonesa, vírus do Nilo Ocidental, filariose), seus padrões de alimentação permanecem subestudados em comparação com gêneros como Anopheles. O "padrão-ouro" atual para identificar fontes de refeição de sangue — técnicas baseadas em DNA (PCR, sequenciamento) e ensaios baseados em antígenos (ELISA) — é frequentemente caro, demorado, exige capacidade laboratorial especializada e sofre de redução na precisão à medida que as refeições de sangue são digeridas ou degradadas. Existe uma necessidade específica de uma alternativa rápida, de baixo custo e escalável que funcione efetivamente em ambientes de recursos limitados e que possa lidar com espécies de Culex, que não foram anteriormente analisadas utilizando esta abordagem.

Metodologia
O estudo empregou uma abordagem de duas fases para desenvolver e validar um pipeline de Espectroscopia de Infravermelho Médio acoplada a Aprendizado de Máquina (MIRS-ML) utilizando Manchas de Sangue Seco (DBS - Dried Blood Spots).

1. Desenvolvimento de Modelo Laboratorial:

   • Geração de Amostras: Culex quinquefasciatus criados em laboratório foram alimentados com sangue de seis espécies de hospedeiros: humano, porco, galinha, bovino, cão e cavalo. O sangue foi coletado via sistema de alimentação por membrana utilizando sangue anticoagulado.
   • Criação de DBS: O conteúdo abdominal foi transferido para cartões Whatman™ 903 Proteinsaver em 6, 12, 24 e 30 horas após a alimentação para simular a digestão.
   • Espectroscopia: As amostras foram escaneadas usando um espectrômetro de transformada de Fourier (FTIR) Bruker ALPHA (faixa de 400–4000 cm⁻¹).
   • Processamento de Dados: Os espectros foram pré-processados para remover regiões afetadas pelo substrato do cartão (900–1100 cm⁻¹) e pelo CO₂ atmosférico (1800–2200 cm⁻¹).
   • Aprendizado de Máquina: Sete algoritmos de ML supervisionados foram testados. Um Perceptron Multicamadas (MLP) foi selecionado como o modelo ideal após ajuste de hiperparâmetros via busca em grade (grid search) e validação cruzada de 5 dobras (5-fold cross-validation). O modelo foi treinado em 80% dos dados e validado em um conjunto de teste de 20% retido.

2. Validação de Campo:

   • Coleta: Mosquitos que se alimentaram de sangue foram coletados de locais de campo nas Filipinas (Central Luzon e Cordillera) e Austrália (Queensland) usando armadilhas atraídas por CO₂.
   • Padrão de Referência: A identificação do hospedeiro para amostras de campo foi realizada por extração de DNA, PCR de vertebrados universais (visando COI) e sequenciamento Sanger.
   • Aplicação: O modelo MLP treinado em laboratório foi aplicado aos espectros FTIR de DBS coletados em campo para prever a espécie do hospedeiro.
   • Limiar de Probabilidade: O estudo avaliou o uso de pontuações de probabilidade do modelo para filtrar previsões de baixa confiança, visando melhorar a precisão ao excluir amostras incertas.

Principais Resultados

• Desempenho Laboratorial: O modelo MLP otimizado alcançou 93,6% de precisão na previsão da espécie do hospedeiro a partir de DBS de Cx. quinquefasciatus criados em laboratório, superando significativamente a classificação aleatória (16,7%). A precisão variou ligeiramente por hospedeiro (89% para cão a 97% para porco) e declinou modestamente no ponto de digestão de 30 horas (OR = 0,32 para classificação correta em relação aos pontos temporais anteriores).
• Desempenho de Campo: Quando aplicado a amostras coletadas em campo com hospedeiros conhecidos (validados por PCR), o modelo alcançou 67,9% de precisão. Este desempenho inferior é atribuído às diferenças entre as condições de laboratório e de campo, incluindo a ausência de anticoagulantes em amostras de campo, alimentação direta de hospedeiros vivos em vez de membranas e tempos de digestão desconhecidos.
• Limiar de Probabilidade: A aplicação de um limiar de probabilidade de 0,73 para amostras de campo melhorou a precisão da classificação para 78% para hospedeiros conhecidos, embora isso tenha exigido a filtragem de 21% das amostras (40 amostras).
• Generalização: O modelo, treinado em Cx. quinquefasciatus, previu com sucesso as espécies de hospedeiros para outros gêneros (ex: Aedes e Armigeres) coletados em campo, identificando corretamente 6 de 10 espécies não-alvo.
• Comparação com PCR: No conjunto de dados de campo das Filipinas, 29,6% das amostras falharam na amplificação via PCR, enquanto o MIRS-ML forneceu previsões para todas as amostras, sugerindo maior utilidade para amostras degradadas ou de digestão tardia.

Principais Contribuições

• Primeira Aplicação em Culex: Este estudo representa a primeira aplicação de MIRS-ML para identificar fontes de refeição de sangue em mosquitos Culex, um gênero de crescente preocupação para doenças transmitidas por vetores.
• Utilidade de DBS: Demonstra a viabilidade do uso de Manchas de Sangue Seco em papel de filtro como um meio de armazenamento estável e em temperatura ambiente para análise MIRS, superando desafios de preservação associados a mosquitos secos.
• Escalabilidade: O método oferece uma alternativa rápida ao sequenciamento; escanear 203 DBS levou um dia de trabalho, comparado a 15 dias de trabalho para o fluxo de trabalho de sequenciamento gênico.
• Custo-Efetividade: A abordagem utiliza um único instrumento (espectrômetro FTIR) sem custos contínuos de reagentes, tornando-a adequada para ambientes de recursos limitados.

Significância e Alegações
O artigo afirma que o MIRS-ML com DBS é uma ferramenta prática e escalável para análise de refeição de sangue que pode melhorar a compreensão das interações hospedeiro-vetor para patógenos como o vírus da encefalite japonesa. Os autores sustentam que, embora a precisão de campo seja atualmente inferior à de laboratório, a capacidade do método de funcionar sem infraestrutura molecular especializada e seu sucesso com amostras degradadas o tornam uma adição valiosa aos programas de vigilância. O estudo sugere que o desenvolvimento adicional do modelo, especificamente incorporando amostras coletadas em campo nos conjuntos de treinamento e expandindo a gama de hospedeiros identificáveis, poderia aumentar a precisão da classificação. Os autores concluem que este método é promissor como uma alternativa econômica ao PCR para a vigilância de doenças transmitidas por vetores em larga escala, particularmente em regiões onde as dinâmicas de transmissão de patógenos estão mudando devido às mudanças climáticas e à globalização.