Rapid host species identification from dried bloodspots of Culex mosquito blood meals using Mid-Infrared Spectroscopy

Technische Samenvatting: Snelle identificatie van gastheersoorten uit bloedmaaltijden van Culex-muggen met behulp van mid-infraroodspectroscopie

Probleemstelling
Het begrijpen van de voorkeuren van muggen voor bloedconsumptie is cruciaal voor het afleiden van de transmissiedynamiek van door vectoren overgedragen pathogenen en het optimaliseren van interventiestrategieën. Hoewel Culex-muggen primaire vectoren zijn voor hoog-prioritaire multi-gastheer pathogenen (bijv. Japans encefalitisvirus, West-Nijlvirus, filariasis), blijven hun voedingspatronen minder bestudeerd in vergelijking met genera zoals Anopheles. De huidige "gouden standaard"-methoden voor het identificeren van de bron van een bloedmaaltijd—DNA-gebaseerde technieken (PCR, sequencing) en antigeen-gebaseerde assays (ELISA)—zijn vaak duur, tijdrovend, vereisen gespecialiseerde laboratoriumcapaciteit en kampen met verminderde nauwkeurigheid naarmate bloedmaaltijden worden verteerd of afgebroken. Er is een specifieke behoefte aan een snel, kosteneffectief en schaalbaar alternatief dat effectief functioneert in omgevingen met beperkte middelen en dat effectief kan omgaan met monsters van Culex-soorten, die voorheen niet met deze aanpak zijn geanalyseerd.

Methodologie
De studie maakte gebruik van een tweefasige aanpak om een Mid-Infrarood Spectroscopie gekoppeld aan Machine Learning (MIRS-ML) pijplijn te ontwikkelen en te valideren met behulp van Dried Blood Spots (DBS).

1. Ontwikkeling van het laboratoriummodel:

   • Monstergeneratie: Laboratorium-gekweekde Culex quinquefasciatus werden gevoed met bloed van zes gastheersoorten: mens, varken, kip, rund, hond en paard. Het bloed werd verzameld via een membraanvoedingssysteem met anticoagulantia.
   • DBS-creatie: De abdominale inhoud werd gerold op Whatman™ 903 Proteinsaver-kaarten op 6, 12, 24 en 30 uur na de voeding om digestie te simuleren.
   • Spectroscopie: Monsters werden gescand met een Bruker ALPHA Fourier-transform infrarood (FTIR) spectrometer (bereik 400–4000 cm⁻¹).
   • Gegevensverwerking: Spectra werden voorbewerkt om regio's die worden beïnvloed door het kaartsubstraat (900–1100 cm⁻¹) en atmosferische CO₂ (1800–2200 cm⁻¹) te verwijderen.
   • Machine Learning: Zeven gesuperviseerde ML-algoritmen werden getest. Een Multilayer Perceptron (MLP) werd geselecteerd als het optimale model na hyperparameteroptimalisatie via grid search en 5-voudige kruisvalidatie. Het model werd getraind op 80% van de gegevens en gevalideerd op een onafhankelijke testset van 20%.

2. Veldvalidatie:

   • Verzameling: Bloedverzadigde muggen werden verzameld van veldlocaties in de Filipijnen (Centraal Luzon en Cordillera) en Australië (Queensland) met behulp van CO₂-gelokte vallen.
   • Referentiestandaard: Gastheeridentificatie voor veldmonsters werd uitgevoerd via DNA-extractie, universele vertebrata PCR (gericht op COI) en Sanger-sequencing.
   • Toepassing: Het in het laboratorium getrainde MLP-model werd toegepast op de FTIR-spectra van veldverzamelde DBS om de gastheersoort te voorspellen.
   • Waarschijnlijkheidsdrempelwaarde: De studie evalueerde het gebruik van modelwaarschijnlijkheidsscores om voorspellingen met een lage betrouwbaarheid te filteren, met als doel de nauwkeurigheid te verbeteren door onzekere monsters uit te sluiten.

Belangrijkste Resultaten

• Prestaties in het laboratorium: Het geoptimaliseerde MLP-model behaalde een nauwkeurigheid van 93,6% bij het voorspellen van gastheersoorten uit laboratorium-gekweekde Cx. quinquefasciatus DBS, wat aanzienlijk beter is dan willekeurige classificatie (16,7%). De nauwkeurigheid varieerde licht per gastheer (89% voor hond tot 97% voor varken) en nam licht af bij de 30-uurs digestie (OR = 0,32 voor correcte classificatie ten opzichte van eerdere tijdstippen).
• Prestaties in het veld: Bij toepassing op veldverzamelde monsters met bekende gastheren (gevalideerd door PCR), behaalde het model een nauwkeurigheid van 67,9%. Deze lagere prestatie wordt toegeschreven aan verschillen tussen laboratorium- en veldomstandigheden, waaronder de afwezigheid van anticoagulantia in veldmonsters, directe voeding van levende gastheren in plaats van membranen, en onbekende digestietijden.
• Waarschijnlijkheidsdrempelwaarde: Het toepassen van een waarschijnlijkheidsdrempel van 0,73 op veldmonsters verbeterde de classificatienauwkeurigheid naar 78% voor bekende gastheren, hoewel dit vereiste dat 21% van de monsters (40 monsters) werd uitgefilterd.
• Generaliseerbaarheid: Het model, getraind op Cx. quinquefasciatus, voorspelde succesvol gastheersoorten voor andere genera (bijv. Aedes en Armigeres) die in het veld zijn verzameld, waarbij 6 van de 10 niet-doelsoorten correct werden geïdentificeerd.
• Vergelijking met PCR: In de Filipijnse velddataset faalde 29,6% van de monsters bij amplificatie via PCR, terwijl MIRS-ML voorspellingen leverde voor alle monsters, wat wijst op een hogere bruikbaarheid voor gedegradeerde monsters of monsters in een latere fase van digestie.

Belangrijkste Bijdragen

• Eerste Toepassing op Culex: Deze studie vormt de eerste toepassing van MIRS-ML voor de identificatie van bloedmaaltijdbronnen in Culex-muggen, een genus van toenemende bezorgdheid voor door vectoren overgedragen ziekten.
• Bruikbaarheid van DBS: Het toont de levensvatbaarheid aan van Dried Blood Spots op filterpapier als een stabiel opslagmedium bij kamertemperatuur voor MIRS-analyse, waarmee de uitdagingen van de bewaring van gedroogde muggen worden overwonnen.
• Schaalbaarheid: De methode biedt een snelle alternatief voor sequencing; het scannen van 203 DBS duurde één werkdag, vergeleken met 15 werkdagen voor de gen-sequencing workflow.
• Kosteneffectiviteit: De aanpak maakt gebruik van een enkel instrument (FTIR-spectrometer) zonder doorlopende kosten voor reagentia, wat het geschikt maakt voor omgevingen met beperkte middelen.

Betekenis en Claims
Het artikel claimt dat MIRS-ML met DBS een praktisch, schaalbaar instrument is voor bloedmaaltijdanalyse dat het begrip van gastheer-vectorinteracties voor pathogenen zoals het Japans encefalitisvirus kan verbeteren. De auteurs stellen dat hoewel de nauwkeurigheid in het veld momenteel lager is dan in het laboratorium, de capaciteit van de methode om te functioneren zonder gespecialiseerde moleculaire infrastructuur en het succes met gedegradeerde monsters, het een waardevolle toevoeging maakt aan surveillanceprogramma's. De studie suggereert dat verdere modelontwikkeling, specif door met name het opnemen van in het veld verzamelde monsters in de trainingssets en het uitbreiden van het bereik van identificeerbare gastheren, de classificatienauwkeurigheid zou kunnen verbeteren. De auteurs concluderen dat deze methode veelbelovend is als een economisch alternatief voor PCR voor grootschalige surveillance van door vectoren overgedragen ziekten, vooral in regio's waar de dynamiek van pathogene transmissie verschuift door klimaatverandering en globalisering.